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Faculté de Pharmacie de Monastir Travaux Pratiques d’Immunologie Erythrocytaire

Faculté de Pharmacie de Monastir Travaux Pratiques d’Immunologie Erythrocytaire et Leuco plaquettaire EPU D’HEMATOLOGIE Fascicule Préparé en 2007 par : - Pr. HMIDA Slama - Pr. YACOUB JEMNI Saloua - A.H.U. : B HATIRA Saadia - A.H.U : KAABI Houda - Pr. Ag. MOJAAT Najet Révisé en 2017 par: - Pr. HMIDA Slama - Pr. YACOUB JEMNI Saloua - AHU.ABDELKEFI Saadia -Pr.Ag CHAABANE Manel 1 S O M M A I R E I) Immunologie Erythrocytaire 1) Les difficultés du groupage ABO –Rh 2) Les anticorps naturels et immuns du système ABO 3) La recherche des substances ABH et Lewis dans la salive 4) Epreuve de fixation élution 5) Les anticorps immuns et les méthodes d’agglutination artificielle 5 -1 - Recherche des Ac immuns (RAI) 5 - 2 - Identification des allo anticorps 6) Etude des anémies hémolytiques auto-immunes II) Immunologie leuco- plaquettaire 1) Panel lymphocytaire 1 - 1 - Séparation des lymphocytes totaux sur Ficoll 1 - 2 - Séparation des lymphocytes B sur billes magnétiques 1 - 3 - Congélation des lymphocytes 2) Recherche des Ac anti HLA par lymphocytotoxicité 3) Test de compatibilité lymphocytaire 2 IMMULOGIE ERYTHROCYTAIRE 3 LES DIFFICULTES DU GROUPAGE ABO ET RH I/ GROUPAGE ABO A/ Rappel 1) Le prélèvement 2) Le groupage sanguin 3) Les témoins B/ Difficultés 1) Discordance entre l’épreuve globulaire et sérique avec l’un des témoins positif a) Témoin allo positif b) Témoin AB positif c) Témoin auto positif 2) Discordance entre l’épreuve globulaire et sérique avec des témoins négatifs a) Sang de nouveau-né b) Titre d’anticorps faible (immunodéprimé) c) Allogreffe ABO incompatible : incompatibilité ABO mineures d) La présence d’un anti-A1 naturel e) Les variants du groupe A f) Les variants du groupe B g) Présence d’hémolysines ABO à titre élevé 3) Problèmes particuliers a) La double population b) Les fausses agglutinations : phénomène de rouleaux II/ GROUPAGE RHESUS A/ Introduction B/ Les réactifs 1) Les réactifs anti-D polyclonaux 2) Les réactifs anti-D monoclonaux C/ Techniques 4 LES DIFFICULTES DU GROUPAGE ABO ET RH I - GROUPAGE ABO A - Rappel 1 - Prélèvement - Le prélèvement est effectué à la veine du pli du coude avec ou sans anticoagulant - L’étiquette doit mentionner de façon lisible :  Le nom et le prénom, la date de naissance  Le numéro d’enregistrement La sécurité du résultat dépend de la qualité du prélèvement et de l'exactitude et de la précision des informations transmises au laboratoire. De même, les données de l’hémovigilance soulignent la persistance d'accidents transfusionnels dus à une fréquence encore trop élevée d'erreurs d'identification (ou d'usurpations d'identité) au moment du prélèvement. Plusieurs textes légiférés précisent les règles à respecter (circulaire n°60/98 du 05 juin 1998 révisée le 04 juin 2015 sur la sécurité transfusionnelle, manuel de bonnes pratiques) 2 - Groupage Le groupage doit être effectué en double détermination par deux personnes différentes et deux séries de réactifs différentes. Chaque détermination doit comporter aussi bien l’épreuve globulaire que l’épreuve sérique (Beth -Vincent et Simonin-Michon) (circulaire n°32/2015 du 04 juin 2015) Toute discordance entre les épreuves globulaire et sérique interdit de valider le groupe sanguin et impose : - Dans un premier temps de vérifier l'aspect des sérums-tests , leur date de péremption, leur conformité d'activité (résultats des CQI ) ainsi que l’aspect des hématies-tests et l'absence d'altération de l'échantillon de sang à tester. - De différencier dans un deuxième temps, les vraies agglutinations des fausses agglutinations telles que le phénomène de rouleau qui peut être reconnu par une simple visualisation microscopique, et surmonté par un lavage des hématies et une 5 dilution du sérum -De pratiquer dans un troisième temps les trois témoins qui valident l'épreuve globulaire et l'épreuve sérique afin de cerner à quel niveau se situe l'anomalie 3 – Les Témoins - L’épreuve sérique est validée par le témoin allo - L’épreuve globulaire est validée par le témoin AB - Les auto-anticorps sont mis en évidence par le témoin auto. Les auto-anticorps, interfèrent aussi bien dans l’épreuve globulaire que dans l’épreuve sérique. On ne doit jamais donner une réponse définitive s’il n’y a pas de concordance entre l’épreuve globulaire et sérique. 4 – La double population Il ne s'agit pas de difficulté de groupe mais il est important de savoir reconnaître une double population qui se caractérise : - Sur plaque d’opaline par la présence d'agglutinats sur fond rosé d'hématies libres ; - En gel-filtration, par la coexistence d'hématies ayant complètement traversé la colonne sans s'y arrêter avec d'autres qui persistent dans le dispositif - En microplaque, par la constatation d'agglutinats dans un environnement plus ou moins rosé et non limpide. Il peut s'agir d'un réel mélange de deux populations d'hématies possédant des antigènes différents (post-transfusionnel par exemple) ou d'une image de double population due à un antigène faible en présence de certains réactifs (phénotype A3). B - Difficultés En pratique toutes les difficultés du groupage ABO peuvent être placées dans l’un des deux cadres suivants : - Discordance entre l’épreuve globulaire et sérique avec des témoins négatifs - Discordance entre les deux épreuves avec un ou plusieurs témoins l’un des témoins positifs 1 - Discordance entre l’épreuve globulaire et sérique avec un témoin positif a - Témoin allo positif Les anticorps naturels irréguliers interfèrent au niveau de l’épreuve sérique. Cette interférence se 6 traduit par une discordance entre l’épreuve globulaire et l’épreuve sérique. Ces anticorps réagissent à basse température, et sont spontanément hémagglutinants. Les plus fréquemment rencontrés sont : - Les anti-P1 - Les Anti-M et les anti-N - Les anti-H des sujets A1 ou A1B - Les anti-Lewis Pour surmonter la difficulté liée à la présence de ces anticorps, il faut : - Identifier l’allo-anticorps présent dans le sérum du malade à l’aide d’un panel érythrocytaire - Refaire le groupage en utilisant des hématies tests dépourvues de l’antigène correspondant à l’anticorps identifié. b -Témoin AB positif Il est le garant de l’épreuve globulaire, sa positivité se traduit par une discordance entre l’épreuve globulaire et l’épreuve sérique et elle résulte d’une réaction de polyagglutinabilité. La polyagglutinabilité des hématies est un phénomène immunologique. Il s’agit d’un antigène qui est démasqué ou anormalement présent à la surface des globules rouges et reconnu par un anticorps spécifique présent dans la plupart des sérums humains = antiT, antiTn… Les phénomènes de polyagglutinabilité sont classés en deux catégories : les polyagglutinabilités héréditaires et les polyagglutinabilités acquises. ** Les Polyagglutinabilités héréditaires  Polyagglutinabilité de type HEMPAS Les hématies sont lysées à 37°C en présence de sérum acidifié et agglutinées à 4°C par les mêmes sérums, dans la dyserythropoïèse congénitale type HEMPAS (Hereditary Erythroblastic Multinuclearity with a Positive Acidified Sérum lysis test)  Polyagglutinabilité de type CAD La structure antigénique démasquée possède un sucre immunodominant, le N-acétyl Galactosamine, reconnu par la lectine de Dolichos Biflorus. Il en résulte une agglutination avec le sérum test anti A1 (constitué de Dolichos-Biflorus) et ce quelque soit le groupe. ** Les Polyagglutinabilités acquises 7 Deux étiologies sont en cause :  Les polyagglutinabilités d’origine microbienne Elles sont de type T, Th et B acquis. Elles s’observent soit in vitro (contamination microbienne du prélèvement) soit in vivo, lors d’un syndrome infectieux. Elles résultent d’une modification de la membrane érythrocytaire engendrée par l’action des enzymes de certains micro-organismes révélant ainsi les antigènes T, Th, Tk. La polyagglutinabilité associée à l’antigène B acquis est liée à une modification enzymatique de l’antigène A, elle est observée chez un fort pourcentage de sujets atteints d’infections digestives.  Les polyagglutinabilités d’origine non microbienne Elles sont de type Tn, Va. Elles sont dues à l’absorption de certaines molécules comme la pénicilline par exemple à la surface des hématies rendant ces dernières agglutinables par les sérums humains possédant l’anticorps correspondant. c -Témoin auto positif La présence d’un auto-anticorps de classe IgM perturbe aussi bien l’épreuve globulaire que l’épreuve sérique. Toutes les réactions sont fortement positives et le test d’auto-agglutination est positif. Pour surmonter la difficulté au niveau de : °° L’épreuve globulaire : en général, 2 ou 3 lavages en eau physiologique à 37°C permettent d’éluer les auto-anticorps. Si ces lavages restent insuffisants pour éluer la totalité des anticorps, on pratiquera une élution à 56°C pendant 10 mn. L’épreuve globulaire est validée par le témoin AB négatif. °° L’épreuve sérique : la difficulté est surmontée par une ou plusieurs adsorptions du sérum du malade sur des hématies de GS O à + 4°C. L’épreuve sérique est validée par le témoin allo négatif . 2 - Discordance entre épreuve globulaire et sérique avec des témoins négatifs a - Sang de nouveau-né Les anticorps naturels sont souvent de titre faible, voire absents (souvent anticorps anti-A, anti-B 8 maternels) c’est le seul cas ou où une défaillance de l’épreuve sérique peut être acceptée. Le prélèvement revêt une très grande importance. En effet le sang du cordon peut donner lieu à de fausses agglutinations en raison de la présence de mucopolysaccharides et de substance mucoïdes (gelée de Warthon). Il ne faut jamais pratiquer une épreuve globulaire sur sang de cordon sans laver au préalable les globules rouges 6 fois uploads/Finance/ polycopie-tp-ih-2017.pdf