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Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen 2017/2018

Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen 2017/2018 1 TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES UTILISANT UN MARQUEUR People hate what they dont understand. -Martha Kent- Plan du cours I. INTRODUCTION .....................................................................................................................2 Classification des méthodes d’immunomarquage……………………………………………… 2 II. IMMUNOFLUORESCENCE (IF) ................................................................................................2 -Définition ............................................................................................................................................2 -Intérêt de l’immunofluorescence………………………………………………………………… 3 -Deux méthodes d’immunofluorescence : ……………………………………………………………………………….3 1. IF directe (IFD)………………………………………………………………………………..4 2. IF indirecte (IFI)……………………………………………………………………………….4 -Méthode de double marquage…………………………………………………………………...6 III. ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY (ELISA) ...............................................................6 -Définitions………………………………………………………………………………………….7 -Dosage des antigènes :………………………………………………………………………….8 1. ELISA sandwich………………………………………………………………………………8 2. ELISA directe………………………………………………………………………………… 8 3. ELISA par compétition……………………………………………………………………….9 Dosage des anticorps : ………………………………………………………………………….10 1. ELISA indirecte…………………………………………………………………………….. 11 2. ELISA par compétition…………………………………………………………………… 11 IV. DOSAGE RADIO IMMUNOLOGIQUE………………………………………………………11 -Définition………………………………………………………………………………………11 -Deux méthodes : ………………………………………………………………………………12 1. Radio Immuno Assay (RIA)………………………………………………………………12 2. Immuno Radio Metric Assay (IRMA)……………………………………………………12 V. BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………………………………………………12 Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen 2017/2018 2 I. INTRODUCTION : Lorsqu’un antigène est son anticorps spécifique sont mis en contact, des complexes immuns se forment. Ceux-ci peuvent être quantifier à des techniques qui se basent sur l’utilisation d’un marqueur (traceur) qui peut être fluorescent, enzymatique, radioactif ou luminescent. Faut préciser que les techniques d’immunodosage sont divisées en deux types : • Techniques homogènes : effectuées sur phase liquide et ne nécessitant pas un lavage. • Techniques hétérogènes : effectués sur une phase solide (pour la fixation) et nécessite un lavage pour éliminer les éléments qu’on voulait fixer ou combiner mais qu’ils ne le seront pas. Toutes les techniques qu’on verra dans ce cours sont hétérogène. Classification des méthodes d’immunomarquage : Techniques Traceur Immunofluorescence (IF) Fluorescent ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Enzymatique RIA (Radioimmunoassay) IRMA (immunoradiometric assay) Radioactif Chimiluminescence Luminescent II. IMMUNOFLUORESCENCE : Définition : L’immunofluorescence est une méthode d’immunodosage utilisée pour localiser les antigènes en se servant d’anticorps et de marqueurs fluorescents. Un composé fluorescent (FLUOROCHROME = FLUOROPHORE) est un composé qui a la propriété d’émettre de la lumière (à une certaine longueur d’onde λ) quand il est exposé à une autre lumière dont la λ est plus courte. Petite explication : Une lumière est un rayonnement possédant une énergie et une longueur d’onde λ. λ est inversement proportionnel à l’énergie du rayonnement càd moins une lumière possède de l’énergie plus sa λ est grande. Quand un composé fluorescent est exposé à une lumière (λ1 E1), il absorbe une partie de l’énergie de cette lumière de sorte que la partie restante (E2) peut être Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen 2017/2018 3 émise avec une énergie plus faible évidement mais avec une plus grande longueur d’onde λ2, c’est pour ça qu’on a dit qu’un fluorochrome est existé par une lumière avec une plus faible λ que la sienne. La procédure a été décrite par Coombs et consiste à marquer des anticorps avec des fluorochromes aboutissant ainsi à un anticorps conjugué sans qu’il y’ait changement remarquable dans l’activité de l’anticorps. Le marquage se fait par un couplage facile entre le fluorochrome er le groupement amine libre de l’anticorps grâce à la grande affinité que possèdent ces marqueurs pour les protéines (c’est pour ça qu’il est facile) Il y’a plusieurs sortes de fluorochromes pouvant donner plusieurs couleurs, mais les plus utilisés sont : • Fluorescéine aussi appelée Fluorescéine Isothyocinate (FITC) : C’est le plus utilisé de tous les fluorochromes. Il émet une lumière de couleur verdâtre. • Phycoérythrine (PE) : Emet une couleur rouge. • Rhodamine : Emet une couleur rouge. La visualisation de la fluorescence se fait à l’aide d’un microscope fluorescent. Ce microscope est doté d’une source de lumière ultra-violette (UV) qui sera projeté sur notre échantillon marqué, ceci nous permettra de voir nos anticorps fluorescents du fait des phénomènes d’absorption et d’émission de lumière décrits en haut. Intérêt de l’immunofluorescence : Identification des antigènes cellulaires, membranaires, intracytoplasmiques ou nucléaires sur des cellules en suspension ou des coupes tissulaires. Deux méthodes d’immunofluorescence : Il y’a deux procédures employant les anticorps fluorescents : l’immunofluorescence directe (IFD) et l’immunofluorescence indirecte (IFI). Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen 2017/2018 4 1. Immunofluorescence directe (IFD) : Elle utilisée pour identifier la présence d’un antigène précis dans un tissu ou une suspension de cellules/microorganisme par la mise en évidence du complexe immun Ag-Ac fluorescent. Elle implique que le tissu ou le microorganisme cible (contenant l’Ag recherché) interagi directement avec les anticorps fluorescent. Autrement dit, l’anticorps fluorescent est directement fixé sur la préparation antigénique. Après un moment de l’introduction des anticorps fluorescents (le temps pour que les complexes immuns se forment si notre antigène est présent dans l’échantillon), on lave notre préparation pour éliminer les anticorps fluorescents qui sont restés libres càd sans se combiner à leurs antigènes car les laisser ainsi donnera de faux résultats. Après le lavage, la lecture s’effectue au microscope fluorescent. Application de l’IFD : • En Anatomopathologie : Recherche de dépôts d’immunoglobulines, de composants du complément ou d’immuns complexes dans des biopsies tissulaires. • Phénotypage des populations lymphocytaires B et T et des sous- populations de lymphocytes TCD4+ et TCD8+ • Diagnostic direct en : bactériologie (ex : Chlamydiae…), parasitologie (ex : toxoplasmose…) 2. Immunofluorescence indirecte (IFI) : Cette procédure implique en un premier temps la réaction entre l’antigène recherché et un anticorps spécifique non marqué (anticorps primaire). Après un moment (le temps nécessaire pour la formation des complexes immuns), on lave notre préparation pour éliminer les anticorps libres qui pourront fausser les résultats. Ensuite, cette réaction est suivie par une autre réaction entre le premier anticorps (non fluorescent) et un anticorps fluorescent anti-immunoglobuline ultérieurement ajouté (anticorps secondaire), càd que le premier anticorps va jouer le rôle d’antigène pour le second. On lave encore une fois pour éliminer les anticorps anti-Ig fluorescents libres. L’ajout des anti-Ig va donc nous révéler si le premier anticorps c’est bel et bien fixer à son antigène ou non. Autrement dit, cette fixation va nous révéler la présence et d’antigène cellulaire et d’auto-anticorps/anticorps contre un tissu donné. Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen 2017/2018 5 Avantage : Elle est utilisée plus communément car elle est 4 à 10 fois plus sensible que la méthode directe. L’explication de cette grande sensibilité dépend de ce qu’on cherche par cette méthode : a. Si l’élément recherché est un antigène : Lorsqu’un anticorps joue le rôle d’antigène, ce sont ces fragments Fc qui représente le déterminant antigénique de cet anticorps, donc les anti-Ig se liront au fragment Fc de l’anticorps antigénique. Autrement dit, un anticorps primaire peut lier plusieurs anticorps fluorescents secondaires. Prenont l’exemple d’un antigène faiblement exprimé (en petite quantité) : Dans ce cas, utiliser la méthode indirecte donne de meilleurs résultats que la directe, car dans cette dernière, pour chaque deux épitopes il’y a un seul anticorps fluorescent et comme l’antigène est en faible quantité, le signal fluorescent sera faible et difficilement décelable. Par contre, dans la méthode indirecte, pour chaque anticorps primaire lié à son antigène (et qui lui-même joue le role d’un antigène secondaire), il y’a deux ou plusieurs anticorps anti-Ig fluorescents liés à lui. De ce fait, le signal fluorescent est plus grand et facilement décelable par rapport à la méthode directe. Module d’immunologie -Faculté de médecine d’Alger- Abdelmoumene Hacen 2017/2018 6 b. Si l’élément recherché est un anticorps : Ceci est beaucoup plus utiliser pour rechercher les dépôts d’immunoglobuline dans les tissus lors des maladies auto-immunes. L’exemple le plus fréquent est le Lupus érythémateux disséminés (LED) ou LES (s pour systémique). Petite vue sur cette maladie : il s’agit d’une maladie chronique auto- immune, qui survient lorsque le système immunitaire s’attaque aux cellules de l’organisme et les détruit. Le LED touche les femmes 10 fois plus que les hommes. Il peut toucher de nombreuses parties du corps, dont les articulations, la peau, les reins, le cœur, etc. C’est la raison pour laquelle on parle de lupus disséminé ou « systémique ». On trouve dans les tissus atteints du malade des dépôts d’Ig dirigés contre les cellules de ce tissu. Ces dépôts sont révélés par la méthode indirecte. On comprend l’avantage de cette méthode dans le fait qu’on peut utiliser un seul type d’anticorps fluorescents pour déceler la présence de dépôts d’Ig dans n’importe quel tissu car comme on le sait, les Ig possèdent tous une région variante qui diffère d’un anticorps à un autre, et une région constante qui est la même chez tous les anticorps. L’anticorps fluorescent se lira à la région constante de l’Ig qui représente l’anticorps primaire non marqué (on a déjà dit qu’un anticorps peut jouer le rôle d’antigène et que son épitope se situe dans le fragment Fc (région constante)). De ce fait on peut utiliser un seul clone d’anticorps fluorescents pour rechercher les dépôts d’Ig dans plusieurs tissus. Applications de l’immunofluorescence indirecte : ➢ Technique de choix dans le diagnostic immunologique des maladies auto- immunes : • Recherche et titrage des auto-Ac circulants. • Typage des sous-populations de lymphocytes T et des lymphocytes B par marquage de leurs antigènes de surface. ➢ En microbiologie : Sérodiagnostic de la syphilis ➢ En parasitologie : Sérodiagnostic de la toxoplasmose, leishmaniose. Remarque : Les anti immunoglobulines proviennent sont obtenus après uploads/Finance/ resume-abdelmoumene-hacen.pdf