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Cours TAB licence biochimie Mme Djouahra-Fahem Chapitre I : RAPPEL SUR LES TECH

Cours TAB licence biochimie Mme Djouahra-Fahem Chapitre I : RAPPEL SUR LES TECHNIQUES D’ANALYSE BIOCHIMIQUE 1. Introduction Les techniques d’analyses biochimiques englobent l’ensemble des méthodes utilisées pour déterminer la composition chimique d’un échantillon de matière. L’échantillon est soumis à l’analyse soit pour connaître l’identité ou la nature de ses constituants (Méthodes qualitatives), soit pour déterminer les teneurs de ses constituants (méthodes quantitative). 2. Classification des méthodes analytiques Les méthodes analytiques sont souvent classées en deux catégories : 2-1 Méthodes classiques les analyses chimiques sont réalisées en séparant les composants de l'échantillon (appelés analytes) par précipitation, extraction ou distillation. Les composants séparés peuvent ensuite subir :  Une analyse qualitative ; par l’utilisation des réactifs, les produits obtenus dans ce cas sont reconnu par leur couleur, leur température d’ébullition ou de fusion, leur solubilité dans les solvants, leur odeur …etc  Une analyse quantitative ; deux systèmes sont employés dans ce cas : La gravimétrie et la titrimétrie Les outils utilisés dans ce cas, sont donc simples comme la verrerie jaugée (pipettes, fioles...), balances analytiques, pH-mètres…etc 2-2 Méthodes instrumentales A l'opposé des méthodes classiques, les méthodes instrumentales permettent la quantification directe de l'analyte à l'aide de dispositifs électroniques. Elles utilisent des appareillages qui permettent les déterminations en se basant sur des propriétés physiques. Ces méthodes regroupent ; la chromatographie, la RMN, les UV, les IR, l’électrophorèse, la spectrométrie, la microscopie et l’électrochimie Cours TAB licence biochimie Mme Djouahra-Fahem Les Techniques d’Extraction Les techniques d’analyse qualitatives ou quantitative nécessitent que les molécules a analysé soient en solution. Lorsque ces substances a étudiés sont en solution dans un milieu biologique liquide (ex : Plasma sanguin), le travail de préparation est simplifié. Le problème se pose avec les molécules tissulaires, dont il devient indispensable de les extraire. L’extraction est une opération qui consiste à séparer certains composés organiques d’un organisme (animal ou végétal) selon diverses techniques. Dans ce chapitre, on présente quelques techniques d’extraction de composés secondaire des plantes. Extraction des composés secondaire des plantes Les plantes, se caractérisent par deux types de métabolismes primaires et secondaires fournissant deux types de métabolites respectivement primaires en quantités élevées (sucres, lipides, protéines) et secondaires en faibles quantités mais de plus grande importance, il s’agit dans ce cas des principes actifs (huiles essentielles, composés phénolique, saponines, alcaloïdes …etc). II-1- Techniques d’extraction : Trois techniques d’extraction peuvent être employées à fin d’obtenir les principes actifs d’une plantes. A- Extraction chimique (Extraction par solvant ): Une extraction par solvant consiste à extraire une espèce chimique d’un milieu solide ou liquide par solubilisation dans un solvant. Celui-ci peut être de l’eau, mais généralement il s’agira d’un solvant organique, issu de la chimie du pétrole : cyclohexane, éther de pétrole, toluène …etc. Lorsque l’espèce chimique est extraite d’un liquide (mélange ou solution), ce liquide et le solvant extracteur doivent être non miscibles. Au cours de l’extraction on obtient deux phases (ou parties non mélangées). La phase supérieure correspond au liquide dont la densité est la plus faible. La solubilisation peut être effectuée par différentes méthodes :  Infusion : de l'eau bouillante est versée sur les feuilles ou sur les fleurs finement hachées de la plante.  Décoction : la plante est mise dans l'eau froide. Porter à l'ébullition quelques temps. Cette méthode de transformation ne permet pas d'extraire autant de principes actifs que l'infusion, mais elle est adaptée aux racines, écorces pour lesquelles l'extraction est difficile.  Macération : action de laisser séjourner, à froid, dans un solvant organique un B- Extraction mécanique : Cours TAB licence biochimie Mme Djouahra-Fahem Elle repose sur l’utilisation d’installation de dispositifs permettant d’obtenir un produit final pur n’ayant subit aucune modification chimique. Elle est employée essentiellement pour l’extraction des huiles essentielles. Elle se fait selon plusieurs méthodes, les plus employées sont : 1- Distillation à l’eau : hydrodistillation Cette technique consiste à immerger directement la matière première végétale dans un bain d’eau qui est porté à ébullition généralement à pression atmosphérique. La chaleur permet l’éclatement et la libération des molécules odorantes contenues dans les cellules végétales. Ces molécules aromatiques forment avec la vapeur d’eau, un mélange azéotropique, qui est ensuite refroidi, condensé et récupéré. Une fois condensées, eau et molécules aromatiques du fait de leurs différences de densité, se séparent en une phase aqueuse et une phase organique : l’huile essentielle Entraînement à la vapeur L’entraînement à la vapeur d’eau est l’une des méthodes officielles pour l’obtention des huiles essentielles. A la différence de l’hydrodistillation, cette technique ne met pas en contact direct l’eau et la matière végétale à traiter. De la vapeur d’eau fournie par une chaudière traverse la matière végétale située au dessus d’une grille. Durant le passage de la vapeur à travers le matériel, les cellules éclatent et libèrent l’huile essentielle qui est vaporisée sous l’action de la chaleur pour former un mélange « eau + huile essentielle ». Ce mélange sera ensuite véhiculé vers le condenseur et l’essencier avant d’être séparé en une phase aqueuse et une phase organique : l’huile essentielle. L’absence de contact direct entre l’eau et la matière végétale, puis entre l’eau et les molécules aromatiques évite certains phénomènes d’hydrolyse ou de dégradation pouvant nuire à la qualité de l’huile. 2- Hydrodiffusion L’hydrodiffusion est une variante de l’entraînement à la vapeur. Dans le cas de l’hydrodiffusion, le flux de vapeur n’est pas ascendant mais descendant. Comme pour l’entraînement à la vapeur d’eau, l’hydrodiffusion présente l’avantage de ne pas mettre en contact le matériel végétal et l’eau. De plus, l’hydrodiffusion permet une économie d’énergie due à la réduction de la durée de la distillation et donc à la réduction de la consommation de vapeur. 3- L’expression L’expression (ou pression à froid) est réservée aux agrumes : le citron, la mandarine, l’orange douce, l’orange amère, le pamplemousse. Il suffit de presser le zeste de ces agrumes sous un filet d’eau continu. On parle alors d’essence car la dite « huile essentielle » n’est pas obtenue par une distillation à la vapeur. 5- Extraction assistée par micro-ondes Dans ce procédé la plante est chauffée sélectivement par un rayonnement de micro-ondes dans une enceinte dont la pression est réduite de façon séquentielle. Le matériel végétal absorbe donc l’énergie micro-ondes. L’huile essentielle est ensuite entraînée dans le mélange azéotropique formé avec la vapeur d’eau propre à la plante traitée. Très rapide, peu Cours TAB licence biochimie Mme Djouahra-Fahem consommateur d’énergie , ce procédé fournit un produit de qualité et de quantité supérieure à celle obtenue par l’hydrodistillation. C- Extraction enzymatique : L’extraction d’huile avec l’utilisation des enzymes devient une autre alternative qui commence à prendre force. Plusieurs études réalisées dans différents fruits et légumes ont démontré l’efficacité de l’extraction enzymatique en phase aqueuse pour l’obtention d’huile. Ainsi, Selon Graille (1988), une utilisation des enzymes pendant le procédé thermomécanique permet d’extraire le maximum d’huile présente dans les tissus oléifères. Santamaria et al. (2003) ont confirmé cette hypothèse. Ils ont rapporté une augmentation de 53% à 71% dans le rendement de l’huile de noisette par l’utilisation des enzymes. Le type d’enzyme choisi pour l’extraction des huiles joue un rôle très important dans le rendement d’huile obtenue. Les progrès scientifiques réalisés à la fois sur la connaissance des substrats, les mécanismes d’action des enzymes et les conditions de production et de purification de ces enzymes à partir des microorganismes ont permis l’apparition sur le marché des préparations enzymatiques de plus en plus ciblées pour dégrader les parois cellulaires des fruits et des légumes. Étant donné la complexité et la diversité de ses polysaccharides constitutifs, la dégradation de la paroi nécessite une gamme d’enzymes avec des activités multiples. Parmi ces enzymes on cite les hydrolases et les carbohydrolases. . Cours TAB Licence Biohimie Mme Djouahra-Fahem PURIFICATION ET ANALYSE DE MOLECULES BIOLOGIQUES Introduction Après extraction des molécules biologiques (les principes actifs de plante ou les protéines), il est nécessaire de les purifier et de les analyser à fin de déterminer leurs structures et par la suite caractériser leurs fonctions. Les différentes étapes de la purification consistent en des processus successifs de simplification du mélange complexe initial, retrait des déchets cellulaires (membranes, organites), élimination du matériel génétique, élimination ou conservation de certaines protéines en fonction de leurs caractéristiques chimiques (taille, charge électrique, affinité), isolation par affinité spécifique de la protéine d'intérêt. Nous allons pouvoir étudier dans ce chapitre deux techniques instrumentales, très utilisées en biologie pour la séparation, purification, l’analyse et la caractérisation des molécules, il s’agit de la chromatographie et de l’électrophorèse. Chapitre II : Les Techniques Chromatographiques Introduction Datant du début du 20éme siècle, la première chromatographie a été réalisée en 1906 par le botaniste russe Mikhaïl Tswett et consistait à séparer les pigments (chlorophylles brutes) d'une feuille d'épinard, par passage à travers une colonne remplie de carbonate de calcium et éluée par l'éther de pétrole. Dans ces conditions, des zones colorées vertes et jaunes se forment, d’où le nom de Chromatographie : Chroma (Couleur), graphie (Ecrire). Cette invention de la chromatographie d'adsorption par Tswett resta ignorée jusqu'en 1931; où, elle a été exploitée de nouveau uploads/Finance/ techenique-d-x27-extraction.pdf