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Pour faire la synthèse du glucose, la néoglucogenèse contourne les étapes irrév

Pour faire la synthèse du glucose, la néoglucogenèse contourne les étapes irréversibles rencontrées dans la glycolyse. La Glucose 6-phosphatase est une enzyme liée à la membrane du réticulum endoplasmique des cellules du foie et reins (absente dans le cerveau et les muscles). Elle forme un complexe protéique avec la glucose-6-phosphate translocase (T) qui agit à la fois en provoquant l'entrée du glucose-6-phosphate dans la lumière du réticulum endoplasmique et en l'hydrolysant pour libérer le D- glucose. Ce dernier est alors transféré hors du réticulum endoplasmique par des transporteurs de glucose.. Texte Eng: Glucose-6-phosphate phosphatase, catalyzing the final metabolic step of gluconeogenesis, faces the endoplasmic reticulum (ER) lumen. Thus, glucose produced in the ER has to be either exported from the ER into the cytosol before release into circulation or exported directly by a vesicular pathway. Préparation des homogénats de foie de lapin Matériel et réactifs - Deux bechers de 100 ml - Scalpel, balance, moulin électrique, éprouvette, glace en paille. - Centrifugeuse réfrigérée (hautes vitesses), tubes de centrifugation de 50 ml. - Tampon d'extraction constitué de Saccharose 0,25 M, Tris-HCl 5mM (pH 6,5) et EDTA 0,1 mM. Matériel biologique. - Deux lapins (dont un normalement nourri et un autre mis à jeûne) desquels on enlève le foie (F) qu'on lave dans le tampon d'extraction (Saccharose 0,25 M, Tris-HCl 5mM (pH 6,5) et EDTA 0,1 mM). Peser les deux organes et découper les en petits fragments. - Homogénéiser, séparément, les fragments de foie au moulin électrique à couteaux à raison de 100 ml de milieu d'extraction pour 10 grammes de tissus (10% (p/v)). - Centrifuger les homogénats à l'aide d'une centrifugeuse réfrigérée pendant 10 minutes à 15000 g. - Transférer les surnageants dans des flacons propres et conserver les dans la glace. Ils serviront comme source d'enzyme pour tester l'hydrolyse du glucose-6-phosphate (substrat exogène). Ils seront appelés 'homogénats'. Hydrolyse du glucose-6-phosphate par la glucose-6 phosphatase du foie L'évaluation de l'activité glucose-6 phosphatase du foie est réalisée par la vitesse d'hydrolyse du substrat (glucose-6-phosphate. La réaction catalysée par la glucose-6 phosphatase est : Glucose-6-phosphate + H2O --> Glucose + Pi Pi ou phosphate inorganique, est l’ortho-phosphate, forme la plus simple du phosphore (PO4, souvent appelée Pi par les biologistes). Le phosphate libéré est dosé par la méthode de Macheboeuf et Delsal. Matériel et réactifs utiles pour le test d'activité d'hydrolyse du glucose-6- phosphate - Bain-marie à 37°C, tubes à essai en verre, pepettes. - Centrifugeuse de paillasse, microtubes de 2 ml - Spectrophotomètre, cuve de mesure d'absorbance. - Agitateur vortex. - Homogénats (source d'enzyme) résultant de la centrifugation des homogénats de foie (FJ : foie de lapin à jeûne, FN : foie de lapin nourri). - Tampon citrate 0,01 M pH 6,5) ; - Glucose-6-phosphate 0,05 M préparé dans le tampon. - EDTA (Acide éthylène diamine tétra-acétique) 0,01 M préparé dans le tampon. - Acide trichloroacétique (TCA) 10% (p/v). Quel est le rôle de EDTA ?. Dans le milieu réactionnel, EDTA chélate (piège) les ions Mg++ nécessaire à l'activité de la phosphatase alcaline dont l'activité peut interférer avec celle de la glucose- 6 phosphatase, toutes libérant le phosphate. En effet la phosphatase alcaline est bien présente dans le foie et dans d'autres organes comme l'intestin, le rein et l'os. Elle agit sur les esters phosphoriques avec libération du phosphate minéral. Protocole du test d'activité de la glucose-6 phosphatase du foie. Le protocole de dosage prend en compte la présence éventuelle de phosphate préexistant dans les homogénats de foie et ne relevant pas de l'activité de la glucose-6 phosphatase. Le tableau des tests ci dessous montre la répétition des tests deux fois pour chaque type d'homogénat. Le phosphore net de la réaction correspont à la soustraction de la quantité de Pi préexistants (témoins de la réaction) de la quantité totale de Pi obtenue dans les tubes des tests de la réaction. Témoins de la réaction Tests de la réaction Tubes FJ1 FJ2 FN1 FN2 FJ1 FJ2 FN1 FN2 Tampon citrate, pH 6,5(ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 EDTA (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 l'homogénat (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 TCA 10% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 Glucose-6- phosphate 0,1 M (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Incubation à 37°C 30 minutes aprés agitation TCA 10% (ml) 0 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Centrifugation à 7000 g 3 minutes après transfert des contenus des tubes à essai dans des microtubes pour centrifugation. On récupère les surnageants pour y doser le phosphate Après le dernier ajout de TCA 10% pour arrêter la réaction de la glucose-6 phosphatase, placer les tubes dans la glace pendant 5 minutes. Transvaser le contenu des tubes dans des microtubes de deux millilitres. Centrifuger 3 minutes et récupérer 0,5 ml de surnageant pour mesurer le phosphore libéré. Dosage du phosphore par la méthode de Macheboeuf-Delsal (Macheboeuf, M., and Delsal, J. Sur le dosage de très petites quantités de phosphore dans les matières organiques. Bull. Soc. Chim. Biol., 25: 116-120, 1943.) Le phosphate minéral réagit avec le molybdate d'ammonium en solution acide (présence d'acide sulfurique) pour former un complexe, l'acide phosphomolybdique (H3PO4-[(MoO3)12). Un agent réducteur (Sulfite de sodium +hydroquinone) réduit le molybdum du phosphomolybdate pour former un complexe phosphomolyb-2- molybdique ( H3PO4-[(MoO3)12MoO2]2) de couleur bleue, stable et soluble dans l'eau et présente un maximum d'absorbance à 690-720 nm. L’intensité de la coloration du complexe est proportionnelle à la concentration en phosphate. Matériel et réactifs - Tubes à essai, pipettes, vortex, bain marie bouillant (100°C). - Spectrophotomètre et cuves de mesure de l'absorbance. - Surnageants des réactions d'hydrolyse du glucose-6-phosphate. - Acide sulfurique (H2SO4) concentré. - Molybdate d'ammonium 5% (P/V). - Sulfite de sodium 20% (P/V). - Solution acide d'hydroquinone 0,5% - Solution étalon : phosphate monopotassique à 100 µg de phosphore par ml. Manipulation On prépare 13 tubes à essai dont 5 tubes pour la gamme étalon et 8 tubes pour les surnageants (4 tubes témoins de la réaction et 4 tubes de test d'activité). L'acide sulfurique concentré est placé sous la hotte. Le prélèvement se fait par capillarité à laide d'une pipette plongeant dans une éprouvette. Gamme étalon du phosphore Témoins de la réaction Tests de la réaction Tubes P0 P1 P2 P3 P4 FJ1 FJ2 FN1 FN2 FJ1' FJ2' FN1' FN2' Eau (ml) 5,7 5,6 5,4 5,2 4,9 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 KH2PO4, 10 µg/ml (ml) 0 0,1 0,3 0,5 0,8 0 0 0 0 0 0 0 0 Surnageants (ml) 0 0 0 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 H2SO4 concentré (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Incubation à 100°C 15 minutes après agitation au vortex Molybdate (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Sulfite de sodium (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Hydroquinone (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Incubation à l'obscurité 30 minutes après agitation au vortex DO à 690 nm Se rappeler de la loi de bee Lambert dans les dosages spectrophotometriques --> voir cette vidéo. Dosage des protéines dans les homogénats de foie de lapin (TP. Séance 2) Le dosage des protéines est réalisé selon la méthode de Lowry (1951). Pour plus de détail voir la page web 'dosage des protéines pat la méthode de Lowry'. Le dosage des protéines est éffectué selon le tableau : Gamme étalon Homogénat FJ, dilué 20 fois Homogénat FN, dilué 20 fois Tubes 0 1 2 3 4 FJ1 FJ2 FJ3 FN1 FN2 FN3 Eau distillée (ml) 0,8 0,7 0,6 0,4 0 0,7 0,6 0,5 0,7 0,6 0,5 SAB (0,25 mg/ml) en ml 0 0,1 0,2 0,4 0,8 0 0 0 0 0 0 Homogénats dilués 20 x (ml) 0 0 0 0 0 0,1 0,2 0,3 0,1 0,2 0,3 Solution cupro-alcaline * (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Incubation 10 minutes après agitation des tubes au vortex Réactif de Folin (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Incubation à l'obscurité 30 minutes après agitation au vortex Absorbance (DO) à 750 nm Quantité de protéines (mg) * La solution cupro-alcaline est préparée selon le mélange des réactifs suivants, pour 100 ml: 96 ml de réactif A, 2 ml de réactif B et 2 ml de réactif C - Réactif A : Na2CO3 à 2% dans NaOH 0,1 N. - Réactif B : tartrate de Na et K à 2% dans l'eau. - Réactif C : CuSO4, 5 H2O à 1% dans l'eau Présentation des résultats et Compte-rendu (CR) 1- Tracer les courbes des gammes étalons des dosages du phosphore et des proéines. 2- Déterminer l'activité de la glucose-6 phosphatase dans chacun des homogénats de foie. L'expression de cette activité est donnée en µg Pi/heure/ml d'homogénat, en micromoles de Pi/heure/ml d'homogénat et en µg Pi/g de foie. 3- Déterminer le uploads/Finance/ tpneoglucogenese.pdf