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Systématique microbienne (J-Noël Joffin) page 1/20 Anaérobies strictes 1. QU'ES

Systématique microbienne (J-Noël Joffin) page 1/20 Anaérobies strictes 1. QU'EST CE QUE LES ANAÉROBIES STRICTES Découverte L'existence de bactéries incapables de cultiver en présence de dioxygène est connue depuis fort longtemps, tant dans l'environnement que dans certains produits pathologiques. Leur culture en milieu anaérobie simples comme la gélose VF, le montre aisément. Ces bactéries sont inhibées et tuées par l'Oxygène atmosphérique. Causes de la toxicité du dioxygène de l'air En présence de dioxygène, il y a formation de molécules particulières, les peroxydes. Ces peroxydes sont entre autres : l'ion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène ou eau oxygénée... Une réaction est particulièrement importante pour la production d'H2O2 : c'est la réaction de l'oxygène avec les coenzymes flaviniques comme FADH2 : FADH2 + O2 —> FAD + H2O2 Il semble aussi que la dernière réaction de la respiration, la réduction de l'Oxygène, donne dans un premier temps des ions superoxydes : e- + O2 --> O2 .- puis 2H+ + 2 O2 .- --> H2O2 + O2 Pourquoi les peroxydes sont-ils toxiques et comment les éliminer ? Ces peroxydes sont des oxydants puissants qui détruisent les molécules organiques (DNA, protéines) et qu'il faut éliminer par des enzymes comme : • la superoxyde dismutase • la catalase • les peroxydases. D'ailleurs ces peroxydes sont utilisés par le macrophage notamment pour tuer les cellules étrangères. Les êtres vivants qui ne possèdent pas ces enzymes meurent en présence d'oxygène et sont donc anaérobies strictes. Ceux qui en possèdent peu ou seulement des peroxydases cultivent préférentiellement en anaérobiose (Streptococcus, Lactobacillus). Cette interprétation est une approche classique qui sera un jour éclairée par d'autres données : il existe en effet des anaérobies strictes catalase positive ! Certaines bactéries sont mêmes EOS (Extremement Oxygen sensible) : elles ne peuvent survivre, même brièvement, en présence d'une faible concentration de dioxygène. Ces EOS sont très nombreuses dans la flore fécale et appartiennent souvent aux archées. 2. MÉTHODES D'ÉTUDE DES BACTÉRIES ANAÉROBIES STRICTES 2.1. Méthodes pour obtenir et conserver l'anaérobiose a. Maintien de l'anaérobiose Le but fondamental est d'éliminer l'oxygène. Mais il faut de plus éviter qu'il ne revienne : le conditionnement est donc essentiel avec : • des tubes à section étroite • des milieux gélosés où l'oxygène diffuse mal • des milieux sous paraffine ou vaseline • des enceintes hermétiques ou jarres ou des hottes anaérobies. Systématique microbienne (J-Noël Joffin) page 2/20 b. Par régénération des milieux C'est le procédé de dégazage le plus simple : l'ébullition assure par diminution de la solubilité des gaz avec l'augmentation de la température, le départ du dioxygène (et des autres gaz de l'air). c. Anaérobiose par réduction chimique du dioxygène Par molécules réductrices dans le milieu Des molécules peuvent être ajoutées dans le milieu en assurant une certaine anaérobiose. On les utilise donc en combinaison avec d'autres méthodes comme la régénération. Ces molécules ne doivent pas être toxiques pour les microorganismes. On utilise la CYSTÉINE ou des morceaux d'organes contenant de la CYSTÉINE (Cervelle, rein, foie...). En effet la cystéine est réductrice : deux molécules de cystéines s'unissent par un pont disulfure en libérant deux électrons. On utilise aussi le THIOGLYCOLATE de sodium (retrouvé dans les milieux pour hémocultures) appelé en nomenclature systématique ACIDE MERCAPTOÉTHANOÏQUE de formule HS-CH2-COOH. Par l'hydrogène en jarre La génération de l'hydrogène (2) est obtenue par réaction d'ions H+ de l'eau sur l'hydrure (sous forme de borohydrure) : BH4 - −−> BH3 + H- (ion hydrure : un proton entouré de deux électrons donc chargé -) ou H- + H+ −−> H2 L'hydrogène réagit avec l'oxygène (1) en présence d'un catalyseur afin d'éviter l'explosion pour donner de l'eau. 2 H2 + O2 --> 2 H2 O En règle générale, un dégagement de dioxyde de carbone (3) est réalisé en même temps car il favorise la culture de ces bactéries. Les systèmes commercialisés comme GasPack®, sont formés d'un sachet contenant deux comprimés contenant l'un le borohydrure de sodium et de l'acide citrique, le deuxième de l'hydrogénocarbonate de sodium et de l'acide citrique comme dans les comprimés effervescents. L'addition d'eau permet la réaction et impose le placement rapide du sachet dans la jarre et sa fermeture. Il convient d'éviter une flamme proche à cause du dihydrogène. Ces systèmes semblent aujourd'hui abandonnés ou d'usage limité. Système Generbag Biomérieux Le système Generbag Mérieux permet d'obtenir l'anaérobiose par simple ouverture d'un sachet dont la composition n'est pas connue (peut être du fer métallique pulvérisé) mais qui comprend un réducteur de l'atmosphère et un générateur de dioxyde de carbone. d. Par une atmosphère gazeuse artificielle L'air est éliminé par des gaz purs : azote par ex. Des milieux sont conditionnés sous azote comme le milieu pour la galerie API20A. Les enceintes anaérobies sont de même sous une atmosphère artificielle. Systématique microbienne (J-Noël Joffin) page 3/20 Il existe aussi des enceintes de travail anaérobies : Remarque Il existe des molécules permettant de "mesurer" le niveau de l'anaérobiose, le rH2. Ce sont des colorants existants sous deux formes selon l'État rédox du milieu, des indicateurs rédox. Un des plus connus c'est le bleu de méthylène qui est bleu en présence de dioxygène et blanc en milieu réduit. 2.2. Techniques d'isolement a. Isolement en profondeur (technique ancienne) On utilise une série de géloses VF sans recharger entre elles et sans stériliser la pipette. Il faut 6 géloses pour une souche pure et 12 pour un mélange. On préfère aujourd'hui d'autres techniques mais la conservation des souches est ainsi très efficace sans précautions particulières. La récupération des bactéries impose de casser stérilement le tube. Systématique microbienne (J-Noël Joffin) page 4/20 b. Isolement en surface (technique à utiliser aujourd'hui) Non sélectif L'isolement se fera sur milieux riches comme la gélose au SANG frais ou la GC + PV. Il devra être incubé en anaérobiose en jarre. Sélectif Des antibiotiques permettent d'assurer une sélectivité à l'isolement : ex : Kanamycine + Vancomycine pour l'isolement des bacilles gram négatif du genre Bacteroides. Pour les bactéries sporulées, on peut facilement éliminer les formes végétatives et les autres bactéries par chauffage 10 minutes à 80°C. 2.3. Technique pour l'État frais Une effilure de pipette Pasteur recueille un peu de bouillon étuvé. On coupe cette pipette et on la place sur une lame. On obture les extrémités avec de la paraffine fondue. Cette technique ancienne n'est pas facile à mettre en oeuvre dans des conditions de sécurité optimales. Certains auteurs préconisent l'état frais luté tel qu'il était réalisé antan pour toutes les bactéries. Or le lutage risque de provoquer la formation d'aérosols, chauffe la lame, prend du temps : la mobilité sera beaucoup plus facile à détecter sur un état frais classique (bouillon anaérobie) pourvu qu'il soit observé très rapidement. 2.4. Milieux de culture Considérations générales Ce sont des bactéries exigeantes : l'apport de facteurs de croissance est nécessaire en particulier l'hémine ou la vitamine K1 pour certains germes. Le sang (ou le sang laqué) est donc un bon candidat pour l'enrichissement, d'autant qu'il apporte la catalase. L'apport de substances réductrices est utile (cystéine, thioglycolate...) au maintien de l'anaérobiose. Milieux de base Milieu de Schaedler : • peptones et extrait de levure • glucose • tampon TRIS • hémine • Chlorhydrate de L-Cystéine • Vitamine K3 Milieu TGY (trypticase-Glucose-Yeast) • peptones et extrait de levure • glucose • thioglycolate de sodium (réducteur) Milieu VF (viande foie) Milieu VL (viande levure) Systématique microbienne (J-Noël Joffin) page 5/20 Milieux liquides (enrichissement-culture) Bouillon de Schaedler Bouillon VF ou VL Milieu de Rosenow : • peptones • chlorhydrate de cystéine • glucose • chlorure de sodium • indicateur d'Andrade (fuchsine acide) • marbre blanc (carbonate de calcium neutralisant les ions H+) • morceau de cervelle La lecture de ce milieu est très empirique : gaz visible par décollement du bouchon de paraffine, fermentation du glucose (virage au rouge), réduction du milieu (virage au vert et à l'incolore). Milieux solides d'isolement Gélose au sang frais (base : Columbia, Schaedler...) Gélose VF qui reste le milieu de choix pour la conservation des anaérobies strictes. Milieu TSC (Tryptone-Sulfite-Cyclo-sérine) Ce milieu est utilisé pour l'isolement de Clostridium perfringens des eaux. • tryptone • citrate de fer ammoniacal • disulfite de sodium (générateur de sulfite) • cyclosérine (antibiotique) • agar-eau Milieu de Willis • base Columbia • lactose • rouge neutre • émulsion de jaune d'oeuf • (éventuellement : néomycine pour inhiber les Entérobactéries) On peut étaler sur une demi-boîte du sérum anti Cl. perfringens pour inhiber l'action enzymatique. 2.5. Identification Les milieux anciens utilisés sont aujourd'hui détrônés par des techniques miniaturisées, et plus particulièrement par des méthodes mettant en évidence des enzymes en aérobiose. La chromatographie en phase gazeuse peut être utilisée parfois. Milieux classiques pour l'identification • bouillon TY avec addition de glucide ou CTA... avec problème de réduction de l'indicateur. Il faut ajouter alors ajouter de l'indicateur le lendemain pour apprécier l'acidification. (vieille technique !) Galerie API20A La galerie API20A est calquée sur la galerie API20E mais l'inoculation est faite avec un bouillon de Schaedler (additionné de tryptophane) fortement ensemencé et conditionné sous azote. L'incubation est anaérobie. On recherche la fermentation uploads/Geographie/ anaerobies-strictes.pdf