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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L‟ENSEIGNEMENT SUP

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L‟ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITÉ DES FRÈRES MENTOURI CONSTANTINE 1 INSTITUT DE LA NUTRITION, DE L‟ALIMENTATION ET DES TECHNOLOGIES AGRO-ALIMENTAIRES (I.N.A.T.A.A.) N° d‟ordre : N° de série : MEMOIRE En vue de l‟obtention du diplôme de Magister en Sciences Alimentaires Option : biotechnologie et génie des industries alimentaires Thème Isolement de souches bactériennes potentiellement productrices de lipases alcalines, à partir du beurre cru et du beurre fermenté « Dhan » Présenté par : Mlle BELHOULA Nora Mémoire soutenue publiquement le : 09/03/2017 Devant le jury composé de : Présidente : Pr. KHARROUB Karima I.N.A.T.A.A. U.F.M.C.1 Rapporteur : Pr. BEKHOUCHE Farida I.N.A.T.A.A. U.F.M.C.1 Examinatrices : Dr. AMOURACHE Leila I.N.A.T.A.A. U.F.M.C.1 Dr. BECILA - HIOUAL Samira I.N.A.T.A.A. U.F.M.C.1 Année universitaire 2016-2017 Remerciements Je tiens à remercier Allah, le Tout Puissant et le Miséricordieux, de m’avoir donné la santé, la volonté et la patience pour mener à terme ma formation de magister. Je tiens avant tout à remercier le Professeur BEKHOUCHE Farida qui m'a honorée en acceptant de diriger ce travail et pour son encadrement méthodique. Je lui adresse également ma gratitude pour son aide précieuse, ses conseils fructueux, son soutien continu et ses encouragements permanents. Merci de m’avoir guidée avec patience et d’avoir consacré autant d’heures pour les corrections de ce manuscrit. J'exprime mes remerciements aux membres de jury d’avoir accepté d’évaluer ce travail en dépit de leurs nombreuses autres obligations : Mes sincères remerciements au Professeur KHARROUB K., qui a bien voulu accepter de présider ce jury. Je tiens à exprimer ma très grande considération au Docteur AMOURACHE L. et au Docteur BECILA-HIOUAL S., qui m'ont fait l'honneur d’examiner ce mémoire de magister et de me faire ainsi bénéficier de leurs compétences et de leurs connaissances. Je tien aussi à remercier les personnes qui nous ont fourni en smen et en beurre et ne nous ont pas privé d’informations. Je remercier très vivement tous les membres de l’unité SARL HODNA Lait (M’sila) et particulièrement monsieur LATRECHE Bilal qui nous a permis d’effectuer les analyse physicochimiques au niveau de l’entreprise. Mon remerciement particulier au docteur GAGAOUA M., pour son aide scientifique. J’exprime mes vifs remerciements également à tous les membres du laboratoire BIOQUAL Ainsi toute l’équipe VAliTraF pour leur présence et leur aide et spécialement mademoiselle GHANNAI Oulaya. Je suis particulièrement sensible à la confiance qu’ils m’ont témoignée. Mes remerciements vont à tout le personnel des laboratoires pédagogiques de l’INATAA. Sans oublier de remercier tous les enseignants de l’INATAA qui ont contribué à notre formation durant notre parcours universitaire. Enfin, Je tiens à exprimer mes sentiments de reconnaissance à toutes les personnes qui ont participé à ce travail, qui m’ont appris une infinité de choses et qui m’ont aidé, conseillé et soutenu à tout moment afin de réaliser ce travail dans les meilleures conditions. Afin d’être reconnaissant envers ceux qui m’ont appuyé et encouragé à effectuer ce travail, Je dédie ce mémoire : A la mémoire de docteur TRAD KHOUDJA D. Aux membres de ma famille qui ont toujours cru en moi et m’ont soutenue durant ces logues années d’études, pour tous les sacrifices qui ont faits et l’amour qu’ils m’ont apporté. A tous mes amis, vous êtes si nombreux que je ne peux citer tout le monde. Vous ne m’avez jamais laissé tomber, votre soutien je ne l’oublierai jamais : Ghislain, Amira, Asma, Siham, Meriem, Imen (bolba), Imen, Amal, Wissem, Rania et Zina. A mon fiancé Sabir qui m’a toujours soutenu et m’a prêté main-forte dans les moments difficiles. A ma promotion de magister 2014 : Biya, Houria, Ibtissem, Wissem et Ghania (vivent les filles☺) Nora BELHOULA Sommaire Liste des figures Liste des tableaux Liste des abréviations Liste des annexes INTRODUCTION ................................................................................................................... 1 SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE .................................................................................. 3-30 Chapitre 01 : beurre cru et smen 1. Beurre ..................................................................................................................................... 3 1.1. Définition............................................................................................................... 3 1.2. Composition nutritionnelle .................................................................................... 3 1.3. Propriétés ............................................................................................................... 5 1.3.1. Microstructure ........................................................................................... 5 1.3.2. Consistance ............................................................................................... 7 2. Beurre cru ............................................................................................................................... 7 2.1. Procédé de préparation du beurre cru .................................................................... 7 3. Smen ou Dhan ....................................................................................................................... 10 3.1. Définition............................................................................................................. 10 2.2. Composition et valeur nutritionnelle ................................................................... 10 3.3. Procédés de préparation....................................................................................... 11 3.3.1. Salage sans cuisson ................................................................................. 12 3.3.2. Salage et cuisson ..................................................................................... 12 3.4. Consommation du smen dans le monde .............................................................. 13 Chapitre 02 : flore microbienne du beurre cru et du smen 1. Flore microbienne du beurre cru .......................................................................................... 15 1.1. Flore originelle .................................................................................................... 15 1.2. Flore contaminante .............................................................................................. 15 1.2.1. Flore bacterienne pathogène ................................................................... 16 1.2.2. Flore microbienne d‟altération ................................................................ 16 2. Flore microbienne du smen .................................................................................................. 19 2.1. Flore originelle .................................................................................................... 19 2.2. Flore contaminante .............................................................................................. 19 2.2.1. Flore microbienne pathogène .................................................................. 19 2.2.2. Flore microbienne d‟altération ................................................................ 20 Chapitre 03 : lipases microbiennes 1. Définition .............................................................................................................................. 21 2. Microorganismes producteurs de lipases .............................................................................. 22 3. Caractéristiques structurales des lipases .............................................................................. 24 4. Types de réactions catalysées par les lipases........................................................................ 25 5. Mécanisme d‟action .............................................................................................................. 26 6. Mécanisme catalytique ......................................................................................................... 27 7. Détermination de l‟activité lipolytique microbienne ............................................................ 28 8. Application des lipases microbiennes .................................................................................. 29 8.1. Industries Alimentaires........................................................................................ 29 MATERIEL ET METHODES ......................................................................................... 31-47 1. Lieu de travail ....................................................................................................................... 31 2. Démarche expérimentale globale ......................................................................................... 31 3. Matériel biologique : beurre cru et smen .............................................................................. 33 3.1. Origine ................................................................................................................. 33 3.2. Prélèvement et présentation des échantillons ...................................................... 33 3.3. Méthode de recueil des données sur les échantillons .......................................... 35 4. Analyses physicochimiques .................................................................................................. 36 4.1. Mesure du pH ...................................................................................................... 36 4.2. Mesure du taux de la matière grasse, de l‟humidité, de l‟extrait sec total et dégraissé ................................................................................................................................... 36 5. Recherche de bactéries productrices de lipases .................................................................... 37 5.1. Préparation des échantillons ................................................................................ 37 5.2. Milieux utilisés et mise en culture ....................................................................... 37 5.3. Dénombrement des souches ................................................................................ 38 5.4. Isolement des souches lipolytiques ..................................................................... 39 5.5. Conservation des isolats lipolytiques .................................................................. 39 5.6. Screening des isolats potentiellement lipolytiques .............................................. 40 5.7. Caractérisation des isolats lipolytiques ............................................................... 40 5.7.1. Étude morphologique et culturale .......................................................... 40 5.7.2. Test de mannitol-mobilité ....................................................................... 41 5.7.3. Test de la catalase ................................................................................... 41 5.7.4. Test de sporulation .................................................................................. 41 6. Production de lipases ............................................................................................................ 41 6.1. Milieux de culture ............................................................................................... 43 6.2. Culture en milieu liquide des isolats producteurs de lipases ............................... 43 6.2.1. Préparation d‟inoculum ........................................................................... 43 6.2.2. Mise en culture ....................................................................................... 44 6.3. Préparation de l‟enzyme lipase à partir de bouillon de la culture ....................... 44 6.4. Dosage de l‟activité lipasique par titration .......................................................... 44 6.5. Détermination de l‟activité spécifique de l‟extrait brute .................................... 45 7. Étude statistique .................................................................................................................... 46 RESULTATS ET DISCUSSION ...................................................................................... 48-73 1. Résultats ............................................................................................................................... 48 1.1. Collecte des données sur les échantillons............................................................ 48 1.1.1. Identification d‟interviewers ................................................................... 48 1.1.2. Matière première : lait ............................................................................. 48 1.1.3. Prépération du beurre cru et du smen ..................................................... 48 1.2. Analyses physicochimiques ................................................................................ 51 1.3. Recherche de bacréries productrices de lipases .................................................. 51 1.3.1. Dénombrement de la flore totale et la flore lipolytique .......................... 51 1.3.2. Isolement de souches lipolytiques .......................................................... 53 1.3.3. Screening des isolats potentiellement lipolytiques ................................. 53 1.3.4. Caractéristiques des isolats lipolytiques ................................................. 56 1.3.4.1. Examen macroscopique et microscopique ................................. 56 1.3.4.2.Caractéristiques physiologiques et biochimiques des isolats lipolytiques ............................................................................................................................... 60 1.4. Dosage d‟activité lipasique ................................................................................. 60 1.5. Détermination de l‟activité spécifique de l‟extrait brute ..................................... 65 2. Discussion ............................................................................................................................. 67 Conclusion et perspectives ..................................................................................................... 74 Références bibliographiques .................................................................................................. 76 Annexes Résumés Liste des figures Figure 1 : représentation schématique des étapes de la production du beurre (Fox et al., 2015) ................................................................................................................................. 5 Figure 2 : microstructure du beurre à température ambiante (Walstra et al., 2005) ................. 6 Figure 3 : étapes de fabrication du beurre cru algérien (Benkerroum et Tamime, 2004 ; Lahsaoui, 2009 ; Bendimerad, 2013).......................................................................................... 9 Figure 4 : types de barattes traditionnelles ................................................................................ 9 Figure 5 : beurre cru et babeurre (Makhloufi, 2013) ............................................................... 10 Figure 6 : différentes étapes de préparation du smen .............................................................. 14 Figure 7 : image simplifiée du repliement 3D des lipases (Jaeger et al., 1999) ..................... 25 Figure 8 : réactions catalysées par les lipases (Casas-Godoy et al., 2012) ............................. 26 Figure 9 : mécanisme d‟action catalytique (transesterification) des lipases (Jegannathan et al., 2008) ......................................................................................................................................... 27 Figure 10 : protocole expérimental global de notre étude ....................................................... 32 Figure 11 : localisation des régions de prélèvement (Djazaïrouna l‟Atlas pratique de l‟Algérie, 2004) ........................................................................................................................ 34 Figure 12 : différents échantillons collectés (smen et beurre cru) ........................................... 35 Figure 13 : Schéma globale du protocole de culture et de dosage enzymatique de chaque souche ....................................................................................................................................... 42 Figure 14 : courbe d‟étalonnage des protéines du dosage des protéines par la méthode Bradford pour la détermination l‟activité spécifique ................................................................ 46 Figure 15 : diagramme du procédé de préparation de nos échantillons du beurre cru et du smen .......................................................................................................................................... 50 Figure 16 : développement des souches lipolytiques sur des boites de Pétries contenant les milieux GNTH (A) et le GNJO (B) de l‟échantillon de beurre cru .............................................. 52 Figure 17 : hauteurs de lyse selon la méthode de Tansey (1971) ............................................ 54 Figure 18 : répartition des isolats selon la hauteur de lyse sur uploads/Geographie/ bel7088.pdf