Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

ASEPT Sarl 2001 - 1 - Avec l'ouverture d'une unité de biologie moléculaire, AS

ASEPT Sarl 2001 - 1 - Avec l'ouverture d'une unité de biologie moléculaire, ASEPT Sarl poursuit le développement de ses activités de laboratoire (voir http://www.asept.fr/labo.htm) et vous présente une documentation succinte sur : LES OUTILS DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE AU SERVICE DE LA MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE Méthode PCR : détection rapide de bactéries pathogènes – Son atout : détection des bactéries pathogènes dans vos produits alimentaires en moins de 30 heures, – Principe : détection de germes pathogènes (Listeria et Salmonella ) dans les produits alimentaires par caractérisation génotypique. Connaissance de l'écologie microbienne des ateliers de transformation – Caractérisation de souches bactériennes pathogènes (Eschercichia coli, Listeria, Salmonella) ou non par méthode RFLP (digestion enzymatique de l'ADN bactérien) - PGFE (séparation de longs fragments d'ADN par champ pulsé) ; mesure du pourcentage d'homologie entre les souches afin de connaître les origines et les voies de contaminations de vos produits. Pour tout complément d’information, contactez : Corine JABY : c.jaby@asept.fr Muriel COIGNARD : m.coignard@asept.fr Rédaction : mai 1999 Mise à jour avril 2001 Créateur en 1991 du premier stage HACCP en France ASEPT Sarl 2001 - 2 - Sommaire - La technique PCR (Polymerase Chain Reaction) - Détection de Listeria monocytogenes par amplification génique - La technique Nested-PCR (nPCR) - La technique RAPD ou AP-PCR - La technique Reverse-Transcriptase (RT-PCR) - Le Ribotypage - Génotypage des souches bactériennes par macrorestriction - Les puces d’ADN (ou CHIPS) - Génotypage des bactéries pathogènes alimentaires - Comparaison de techniques : Electrophorèse en champs pulsés (RFLP- PFGE) et Ribotypage automatisé (Riboprinter) ASEPT Sarl 2001 - 3 - LA TECHNIQUE PCR (Polymerase Chain Reaction) HISTORIQUE – Découverte du concept technologique : K. Mullis, 1983 – Développement du concept : A. Herlich de la compagnie CETUS, 1985 PRINCIPE La technique PCR permet d’amplifier spécifiquement une séquence d’ADN ou un gène (amplification génique) au moyen d’amorces et de la Taq polymerase. 1 CYCLE PCR comprend trois étapes : – DENATURATION (94-95°C) – HYBRIDATION (35-55°C) – ELONGATION (72-74°C) A chaque cycle : il y a un DOUBLEMENT des copies du fragment d’ADN En général, on réalise 30-35 cycles de PCR (environ 2 h d’amplification) AVANTAGES - SPECIFICITE (100 %), - SIMPLICITE (kit prêt à l’emploi+ automatisation de la méthode), - RAPIDITE (extraction 2h, amplification 2h, détection 1h30). LIMITES - CONTAMINATION (bien cloisonner les différentes étapes) - DÉTECTION DE BACTÉRIES MORTES (recours au pré-enrichissement 16-36h) - PRÉSENCE D’INHIBITEURS DE LA TAQ-POLYMERASE (bien traiter l’étape d’extraction d’ADN ou d’ARN) APPLICATIONS - DETECTION DES BACTERIES PATHOGENES ALIMENTAIRES - DETECTION DES LEVURES et MOISISSURES - IDENTIFICATION BACTERIENNE et FONGIQUE ASEPT Sarl 2001 - 4 - DETECTION DE LISTERIA MONOCYTOGENES PAR AMPLIFICATION GENIQUE Facteur de pathogénicité principal : la Listeriolysine O codé par le gène hlyA DETECTION DE SALMONELLA PAR AMPLIFICATION GENIQUE DETECTION DES FRAGMENTS AMPLIFIÉS : Gel d’agarose (marqueur de poids moléculaire) : révélation avec le BET Hybridation moléculaire sur filtre (Dot-blot) en solution (tech. sandwich) sondes froides et sondes chaudes Gène hlya ST11 ST15 ASEPT Sarl 2001 - 5 - LA TECHNIQUE PCR MULTIPLEX PRINCIPE : Cette technique consiste à utiliser dans un essai PCR : PLUSIEURS PAIRES D’AMORCES (= multiplex) Cela permet de DETECTER PLUSIEURS MICRO-ORGANISMES à la fois EXEMPLES D’APPLICATIONS : Recherche des LISTERIA et en particulier L. monocytogenes Travaux de Border et al., 1990 Utilisation de 3 paires de primers : U1/U2 : gène codant l’ARNr 16S U1/LI1 : gène codant l’ARNr 16S LM1/LM2 : gène hlyA U1/U2 : primers universels U1/LI1 : primers Listeria spp. LM1/LM2 : primers de L.monocytogenes ASEPT Sarl 2001 - 6 - LA TECHNIQUE Nested-PCR (nPCR) Cette technique est basée sur la réalisation de DEUX PCR SUCCESSIVES destinées à amplifier spécifiquement une séquence d’ADN précise. PCR-1 : couple d’amorces externes PCR-2 : couple d’amorces internes ADN cible PCR-1 Produit PCR-1 PCR-2 Principal produit PCR-2 ASEPT Sarl 2001 - 7 - Avantages : – augmenter le rapport de spécificité entre produits spécifique et non spécifiques – diluer l’échantillon porteur d’inhibiteurs éventuels Problème de la PCR On ne peut pas augmenter indéfiniment le nombre de cycles car il existe un plateau d’amplification. Parfois le produit PCR reste toujours indétectable d’où la présence de faux négatifs. – RECOURS À LA n-PCR – SOUTHERN-BLOT Sensibilité : n-PCR + BET = sPCR + Southern-Blot nPCR est 102 à 103 plus sensible que la sPCR ASEPT Sarl 2001 - 8 - LA TECHNIQUE RAPD ou AP-PCR Réaction d’amplification avec des amorces arbitraires RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA AP-PCR : Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Cette technique , simple et rapide, permet de détecter des différences sur des petites séquences d’ADN et ainsi différencier des souches entre elles. Génération de fragments PCR plus ou moins longs Séparation des fragments amplifiés par éléctrophorèse en gel d’agarose à diverses concentrations Analyse des profils électrophorétiques afin d’apprécier la similarité des souches d’un point génomique Génome bactérien Amplification ASEPT Sarl 2001 - 9 - LA TECHNIQUE Reverse-Transcriptase (RT-PCR) La transcriptase reverse catalyse la réaction : La réaction d’amplification s’effectue à partir de l’ADN c. Cette technique est intéressante dans la mesure où elle permet d’amplifier un gène qui est exprimé dans la cellule bactérienne. Ensuite, il est possible de conduire des analyses fines de séquençage sur le gène amplifié. ARN m 5’ 3’ AAAAA ADN c TTT Dénaturation Transcriptase réverse ADN c TTT ADN Polymérase I Nucléase S1 ADN c ARN m ARN m 5’ 3’ AAAAA ADN c ASEPT Sarl 2001 - 10 - LE RIBOTYPAGE Cette technique consiste à digérer l’ADN génomique par des enzymes de restriction et hybrider les digests avec une sonde complémentaire de l’ADNr GENOTYPAGE DES SOUCHES BACTERIENNES PAR MACRORESTRICTION Cette méthode de génotypage est une combinaison de deux techniques : la RFLP et la PFGE RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis L’ANALYSE RFLP C’est une technique qui permet d’étudier le polymorphisme de la séquence d’ADN à l’aide d’enzymes de restriction. Une enzyme de restriction coupe l’ADN à des sites spécifiques appelés PALINDROMES. Il existe une cinquantaine d’enzymes de restriction connues EcoRI AccI La digestion de l’ADN génomique, par des enzymes de restriction qui ont des sites de coupure rares, génère de grands fragments (50 à 100 kb) GAATTC CTTAAG GT(A/C)(T/G)AC CA(T/G)(A/C)TG ASEPT Sarl 2001 - 11 - La séparation des grands fragments se fait ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE (Schwartz et Cantor, 1984) ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE Principe : La séparation repose sur l’effet tamisant du support solide (agarose ou gel de polyacrylamide) Les acides nucléiques sont chargés négativement car ils renferment un groupement phosphate. Vitesse de migration = f (Taille de la molécule) Les molécules sont soumises à deux champs électriques d’orientations différentes et appliqués de façon alternative. Les molécules d’ADN migrent en adoptant un mouvement de reptation. A chaque changement de direction du champ électrique, les molécules subissent un phénomène de réorientation. C’est l’écart dans les durées de réorientation que l’on obtient la séparation de deux molécules de tailles différentes. Différentes techniques sont utilisées en PFGE notamment la technique CHEF (Contour- Clamped Homogeneous Electric Field) LES PUCES D’ADN (ou CHIPS) Cette méthode, actuellement en phase expérimentale, permettra d’identifier et de doser les constituants d’un mélange complexe d’ADN ou d’ARN grâce à l’hybridation en parallèle sur une centaine de microsurfaces greffées avec des sondes. En d’autres termes : analyse simultanée de plusieurs dizaines de milliers d’espèces d’ARNm, dont les niveaux d’expression varieront de 1 à 10 000 transcrits / cellule. Une puce ADN peut être comparée à un four d’hybridation miniaturisé ASEPT Sarl 2001 - 12 - GENOTYPAGE DES BACTÉRIES PATHOGENES ALIMENTAIRES TECHNIQUES PCR-RFLP : amplification spécifique + digestion par 1 ou 2 enzymes de restriction RFLP-PFGE : digestion par 1 ou 2 enzymes de restriction + champ pulsé RAPD-PFGE : amplification aléatoire + champ pulsé RIBOTYPAGE : digestion de l’ADN génomique par 1 ou 2 enzymes de restriction + électrophorèse + hybridation avec une sonde FINALITE DE CES TECHNIQUES : EMPREINTE GÉNÉTIQUE POUR CHAQUE SOUCHE BACTÉRIENNE (sous forme de CODE BARRE) ASEPT Sarl 2001 - 13 - GENOTYPAGE DES BACTÉRIES PATHOGÈNES ALIMENTAIRES OBJECTIF : Meilleure tracabilité des souches bactériennes APPLICATION : Délai : 1 semaine Coût : entre 600 et 700 F H.T. INTERPRETATION : nAB : nombre de bandes communes entre A et B nA : nombre total de bandes dans la piste A nB : nombre total de bandes dans la piste B M A B C R Coeff. de Dice = 2 nAB nA + nB nBnB A : souche A B : souche B C : souche C R : souche de référence M : marqueur de PM ASEPT Sarl 2001 - 14 - Comparaison de techniques Electrophorèse en champs pulsés (RFLP-PFGE) Ribotypage automatisé (Riboprinter) Ce sont deux méthodes permettant d’obtenir l’empreinte génétique des bactéries. La technique d’électrophorèse en champs pulsés consiste à digérer l’ADN bactérien par des enzymes de restriction à sites de coupure rares. Ainsi, des fragments d’ADN de taille > 20 Kb sont générés. Ces fragments sont ensuite séparés par électrophorèse en champs pulsés. Le principe du ribotypage automatisé repose sr la digestion de l’ADN bactérien uploads/Geographie/ bio-1.pdf