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UNIVERSITE DE LA MANOUBA INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE SIDI THABET LI

UNIVERSITE DE LA MANOUBA INSTITUT SUPERIEUR DE BIOTECHNOLOGIE DE SIDI THABET LICENCE APPLIQUEE : BIOTECHNOLOGIE APPLIQUEE AU SECTEUR PHARMACEUTIQUE MEMOIRE DU STAGE DE FIN D’ETUDES RECHERCHE DE LISTERIA ET DE SALMONELLA DANS DIFFERENTES MATRICES ALIMENTAIRES BEN BEN BEN BEN SAAD SAAD SAAD SAAD E E E EMNA MNA MNA MNA Mémoire de stage de fin d’études soutenu à Sidi Thabet le 08 juin 2011 devant le jury composé de : Mme : MAHJOUB Mouna Présidente Mme : BELGUITH Khaoula Examinatrice Mme : GHARSALLAH Sonia Encadrante ISBST Mme : BARKALLAH Insaf Encadrante Entreprise Mlle : HELEL Salma Co-encadrante Entreprise Sidi Thabet سيدي ثابت Dédicaces Dédicaces Dédicaces Dédicaces A mes adorables mères Fattouma et Zohra, Mon cher père Lotfi et mon trésor Hamdi, Pour l’amour qu’ils m’ont toujours porté, pour leur persévérance, Pour leur aide et encouragement permanents, y compris dans les moments de découragement et de doute, C’est à vous que je dois tout. Vous vous êtes dépensés pour moi sans compter et vous avez toujours été là pour moi. En reconnaissance de tous les sacrifices consentis par tous et chacun pour me permettre d’atteindre cette étape de ma vie, Que ce travail, soit le témoignage de mon profond respect et ma gratitude, A tous mes amis, qu’ils trouvent ici l’expression de mon dévouement pour leur soutien A toutes les belles rencontres tout au long de ma vie studieuse, A ceux qui me sont chers, Je dédie ce travail MAMANI Remerciements Remerciements Remerciements Remerciements Au terme de ce travail, je remercie tous ceux Qui ont participé de près ou de loin à l’élaboration de mon projet de fin d’études dans les meilleures conditions. On dit toujours que le trajet est aussi important que la destination, C’est pour ça que je tiens à remercier en premier lieu Les enseignants de l’ISBST à qui je dois ma formation et qu’ils soient assurés de ma sincère gratitude. J’exprime mes vifs remerciements à mes encadrantes : Mme GHARSALLAH Sonia et Mlle HELEL Salma Qui ont bien voulu m’encadrer, pour l’effort fourni, les conseils prodigués, leur patience et leur persévérance dans le suivi, Ma gratitude s’adresse également à l’ensemble du personnel du CNSTN pour leur accueil chaleureux ainsi que leur disponibilité et à leur tête Mme BARKALLAH Insaf chef d’unité de microbiologie et Biologie Moléculaire et Mme Hmaeid Fatma maître-assistante à l’unité de Microbiologie et Biologie Moléculaire au CNSTN Je remercie très sincèrement, les membres de jury d’avoir bien voulu Accepter de faire partie de la commission d’examinateur. Liste des abréviations ADN : Acide désoxyribonucléique BET : Bromure d’éthidium BPF : Bonnes pratiques de fabrication BPH : Bonnes pratiques d’hygiène BRC: British Retail Consortium dNTP : désoxyribonucléosides triphosphate g : gramme h: heure HACCP : Hazard Analysis Critical Control Point H2S: Sulfure d’hydrogène ISO: International Organization for Standardization KDa: kilo Dalton L.: Listeria M: Molaire min : Minute ml : Millilitre mM : Milli molaire nM : Nano molaire Pb : Paire de base PCR : Polymeras Chain Reaction pH : potentiel hydrogène S. : Salmonella spp. : Espèces TBE : Tris Borate EDTA Tr/min : tours par minute U : unité UV : ultra-violet °C : degré Celsius µl : microlitre µm : micromètre µM : micro molaire Liste des figures Figure 1 : La migration des amplicons par électrophorèse sur gel d’agarose ......................... 11 Figure 2 : Culture de Listeria sur milieu sélectif Oxford........................................................ 12 Figure 3 : Résultats des tests biochimiques réalisés sur galerie Api d’une souche alimentaire de L.monocytogenes AD .......................................................................................................... 13 Figure 4 : Profil d’amplification du gène iap des souches de genre Listeria isolées .............. 14 Figure 5 : Profil d’amplification du gène hlyA des souches de genre Listeria isolées ........... 15 Figure 6 : Culture de Salmonella sur milieu sélectif Hektoen et SS agar ............................... 16 Figure 7 : Résultats des tests biochimiques réalisés sur galerie Api d’une souche alimentaire de Salmonella .......................................................................................................................... 17 Figure 8 : Profil d’amplification du gène JEO402-1 de la souche de Salmonella isolée........ 17 Liste des tableaux Tableau 1 : Origines des échantillons analysés......................................................................... 6 Tableau 2 : Composition du Mix de la réaction de PCR......................................................... 10 Tableau 3 : Séquences des amorces utilisées dans les réactions de PCR............................... 11 Tableau 4 : Programme et cycle d’amplification .................................................................... 11 Tableau 5 : Les résultats des tests biochimiques utilisés pour identifier les souches appartenant au genre Listeria .................................................................................................. 13 Tableau 6 : Résultats des tests sur galerie Api Listeria .......................................................... 14 Tableau 7 : Les résultats des tests biochimiques utilisés pour identifier les souches appartenant au genre Salmonella............................................................................................. 16 Tableau 8 : Résultat d’un test sur galerie Api 20E.................................................................. 17 Sommaire Introduction générale Introduction générale Introduction générale Introduction générale ..................................................................................................... 1 Etude Bibliographique Etude Bibliographique Etude Bibliographique Etude Bibliographique .................................................................................................... 2 I. Listeria : agent pathogène des aliments ............................................................................. 2 1. Présentation du genre Listeria......................................................................................................2 2. Listeria et les aliments......................................................................................................................2 2.1. Lait et produits laitiers ............................................................................................. 2 2.2. Viandes et produits carnés ....................................................................................... 3 2.3. Volailles et œufs ...................................................................................................... 3 2.4. Poissons et produits de la pêche.............................................................................. 3 2.5. Produits d’origine végétale ...................................................................................... 3 3. La pathologie de Listeria monocytogenes: la listériose…………………………………..3 II. Salmonella : agent pathogène des aliments........................................................................ 3 1. Présentation du genre Salmonella...............................................................................................3 2. Salmonella et les aliments...............................................................................................................4 2.1. Volailles et œufs ...................................................................................................... 4 2.2. Viandes et produits carnés ....................................................................................... 4 2.3. Lait et produits laitiers ............................................................................................. 4 2.4. Poissons et produits de la pèche............................................................................... 4 3. La pathologie de Salmonella : la salmonellose…………………………………………...5 Objectifs du travail Objectifs du travail Objectifs du travail Objectifs du travail........................................................................................................... 5 Matériel et méthodes Matériel et méthodes Matériel et méthodes Matériel et méthodes....................................................................................................... 6 I. Matériel biologique ............................................................................................................ 6 1. Isolement de Listeria selon la norme NF ISO 11290-1 ........................................................7 2. Isolement de Salmonella selon la norme NF ISO 6579 ........................................................7 III. Identification biochimique des souches isolées .............................................................. 7 1. Tests biochimiques classiques communs aux genres Listeria et Salmonella..............7 1.1. Le test Gram............................................................................................................. 8 1.2. Le test catalase ......................................................................................................... 8 1.3. Le test oxydase......................................................................................................... 8 2. Identification biochimique de Listeria .......................................................................................8 2.1. Test hémolyse .......................................................................................................... 8 2.2. Identification biochimique rapide : Galerie Api Listeria......................................... 9 3. Identification biochimique de Salmonella ................................................................................9 3.1. Culture sur Kligler-Hajna......................................................................................... 9 3.2. Identification biochimique rapide par galerie Api 20 E........................................... 9 IV. Identification moléculaire des souches isolées par PCR................................................. 9 1. Extraction de l’ADN total par choc thermique........................................................................9 2. Réaction de polymérisation en chaine : PCR ........................................................................10 3. Analyse électrophorétique...........................................................................................................11 Résultats et Discussion Résultats et Discussion Résultats et Discussion Résultats et Discussion................................................................................................. 12 • Résultats...................................................................................................................... 12 I. Isolement et identification des souches de genre Listeria................................................ 12 1. Isolement............................................................................................................................................12 2. Identification morphologique, biochimique des souches isolées.................................12 2.1. Identification par les tests classiques ..................................................................... 12 2.2. Identification par le système ApiListeria............................................................... 13 3. Caractérisation moléculaire des souches isolées................................................................14 3.1. Détection du gène iap............................................................................................. 14 3.2. Détection du gène hly ............................................................................................ 15 II. Isolement et identification des souches de genre Salmonella .......................................... 15 1. Isolement............................................................................................................................................15 2. Identification morphologique, biochimique des souches isolées.................................15 2.1. Identification par les tests classiques...........................................................................................15 2.2. Identification par le système Api 20E.........................................................................................16 3. Caractérisation moléculaire des souches isolées................................................................17 • Discussion ................................................................................................................... 18 1. Le choix des pathogènes alimentaires étudiés ....................................................................18 2. Incidence de Listeria dans les denrées alimentaires........................................................18 3. Incidence de Salmonella dans les denrées alimentaires.................................................19 Conclusion générale Conclusion générale Conclusion générale Conclusion générale........................................................................................................ 20 Introduction générale Introduction générale Introduction générale Introduction générale La sécurité sanitaire des aliments constitue pour l’homme l’une des priorités à l’échelle mondiale. Au cours des dernières décennies, la croissance des maladies d’origine alimentaire dans le monde en particulier en Tunisie a souvent été liée à la présence des microorganismes où à leurs toxines dans les aliments. Les pratiques d’hygiène lors de la récolte, la transformation et la commercialisation mises en œuvre dans ce pays pourraient être à l’origine d’un accroissement du nombre de pathogènes reémergents ou récemment identifiés. Les dangers qui représentent un risque pour la sécurité des aliments peuvent intervenir à n’importe quel stade de la chaine alimentaire, depuis la récolte de la matière première, jusqu’à la consommation en passant par la transformation. Malgré la présence des pratiques sécuritaires de préparation des aliments impliquées par les autorités sanitaires qui déploient beaucoup d’efforts dans le cadre du contrôle de ces affections, les toxi-infections alimentaires (TIA) et les toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) sont en recrudescence surtout pour la population de patients immuno-compromis hautement susceptibles aux pathogènes alimentaires. Ainsi il est important d’utiliser des méthodes rapides et efficaces de détection et d’identification des germes pathogènes afin de les détecter le plus tôt possible dans la chaine alimentaire pour développer ensuite les moyens de prévention appropriés. Par ailleurs, ce sujet vise à réaliser un isolement et une caractérisation biochimique et moléculaire dans le but de mieux connaitre les souches du genre Listeria et Salmonella impliquées dans les contaminations alimentaires et mieux situer leur degré de pathogénicité. Etude Bibliographique Etude Bibliographique Etude Bibliographique Etude Bibliographique I. Listeria : agent pathogène des aliments 1. Présentation du genre Listeria Listeria spp. sont des germes psychotrophes, capables de se multiplier à des températures comprises entre -2°C et 45°C, avec un optimum entre 30 et uploads/Geographie/ memoire-du-stage-de-fin-detudes.pdf