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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUP

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE MOHAMED BOUDIAF - M’SILA Mémoire présenté pour l’obtention Du diplôme de Master Académique Par: ABBES Samiha et BOUTERAA Imane Intitulé Soutenu le 25/05/2017 devant le jury composé de: BENDIF Hamdi MC(B) Université de M’sila Président HARIR Mohamed MA(A) Université de M’sila Rapporteur GUATOUACHE Mourad MA(A) Université de M’sila Examinateur Année universitaire : 2016 /2017 Identification phénotypique de quelques isolats d’actinobacteries présentant une activité antimicrobienne vis-à-vis des microorganismes pathogènes. FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DES SCIENCE DE LA NATURE ET DE Vie N° :……………………………………….. DOMAINE : SCIENCE DE LA NATURE ET DE la VIE FILIERE : BIOLOGIE OPTION : BIOTECHNOLOGIE VEGETALE ET METAGENOMIQUE INTRODUCION Nous remercions Allah tout puissant qui nous a donné la santé, le courage et la patience afin de pouvoir accomplir ce modeste travail. Nous tenons à exprimer notre sentiments de reconnaissance à toutes les personnes qui ont participé à ce travail, qui nous avons appris une infinité de choses et qui nous avons aidé, conseillé et soutenu à tout moment afin de réaliser ce travail dans les meilleurs conditions. En premier lieu, nous adressons toute notre gratitude a notre encadreur Monsieur Harir Med, nous le remercie pour sa gentillesse, son soutien et pour partager son expérience, nous adressons toute nos reconnaissance pour sa patience, ses conseils, sa compétence, sa disponibilité et sa participation active lors de la rédaction de mémoire. Nos remerciements sont également adressés à Monsieur Bendif Hamdi qui a accepté de présider le jury de notre soutenance et pour son aide et conseillles et Monsieur Guatouache Mourad qui a accepté travail, nos remerciement tous les enseignants de département des sciences et de la nature de la vie Nous exprimons également à Monsieur Meddah Mohamed Tahar pour leur aide et leurs conseils lors de la rédaction de cette mémoire. Nous adressons nos remerciements également aux Ingénieurs de laboratoires: Hamza, Asma, Halima, et Hanane, Amel, safia , Hassiba Enfin, Nous remercions tous ceux, ce qui participer de prés ou de loin pour la réalisation de ce travail Remerciements i TABLE DES MATIERES Liste des abréviations. Liste des figures. Liste des tableaux. Introduction générale………………………………………………………………………. 1 Chapitre I : Partie Bibliographique I. Le sol…………………..…………………………………………………........................... 4 I.1. La rhizosphère …………………………………………………………........................... 4 I.2. Les actinomycètes rhizosphériques ….………………………………………………….. 4 II. les Actinobactéries…………..……………………………………………………… 5 II.1. Historique……………………….. ………………………………................................... 5 II.2. Définition des actinobactéries………………………………………………………….. 5 II. 3. Caractéristique générale d'actinobactéries …………………………………………….. 6 III. Taxonomie et critères de classification des actinobactéries………………….............. 7 III.1. Systématique des actinobactéries…………………….……............................................ 7 III.2. Evolution des critères d’identification………………………………………………….. 9 III.3. Critères actuels d’identification….……………………..………………………………. 10 III .3.1. Caractères morphologiques……..………………………………………………… 10 III.3.1.1.Caractéristiques culturales ou macromorphologiques………………………………. 10 a. Mycélium aérien……………………………………………………………….. 11 b. Mycélium de Substrat………………………………………………………… . 11 III .3.1.2. Caractéristiques micromorphologiques ………………….….................................. 12 III.3.2. Critères chimiques (chimiotaxonomie)……………………………............................. 14 III.3.3. Critères physiologiques………………………………….………………………….. 14 III .3.3.1. Le pH………………….………………………………............................................ 14 III .3.3.2. Température …………………..………………………………............................... 14 III .3.3.3. Tolérance pour NaCl …….…………………….. ………………………………….. 15 III.3.4. Critères moléculaires………………………….………………….…........................... 15 VI. Cycle de développement d'actinobactérie………………..………………………………. 16 VI.1. Formation des spores par les actinobactéries……………………………………….... 18 VI.1.1. Exo-spores………………………..…………………………....................................... 18 VI.1.2. Endospores……………………………………………………………….. 19 ii V. Habitat d'Actinobactéries…………………………………….......................................... 20 V.1. Envirennement terrestres……………….…………………………………………………… 20 V.2. Eaux douces et marines ……………………………………….………….…………………….. 21 V.3. Air ……………………………………………………………………………………… 21 V.5. Composts ……………………………………………………………………………….. 22 V.6. Végétaux, animaux et l’homme………………….……………………………………… VII. Applications des actinobactéries……………………………………………………... VII .1. Antimicrobiens……………………………………………………………………….. VII .2. Enzymes………………………………………………………………………………. VII .3. Bioherbicides…………………………………………………………………………. VII .4. Vitamines…………………………………………………………………………….. VII .5. Pigments……………………………………………………………………………... VII .6. Bioremédiation………………………………………………………………………. VIII. Utilisation des actinobactéries en lutte biologique ……………………………….... 22 22 23 24 26 27 27 28 29 Chapitre II : Matériels et méthodes I. Prélèvement des échantillons …………………………………………………………… 30 I.1. Sol ……………………………………………….…………………………................... 30 I.2. Eau ……………………………………………….……………………………………… 30 I.3. Isolement des actinobactéries ………………… ……………….…………....................... 30 I.3.1. Prétraitement de l’échantillon ………………………………....................................... 30  Traitement par la chaleure ………………………………………............................... 30  L’enrichissement des échantillons par l’addition de CaCO3 ……………………….. 30 I.3.2. Dilution et ensemencement …………………………………......................................... 31  Ensemencement en masse ………………………………………………………………….. 31  Ensemencement en surface …………………………………………................................. 31 I.3.3. Sélection des actinobactéries ……………………………….………………................. 32 I.3.4. Purification et conservation des actinobactéries ………………………………….…… 32 I.4. Milieux de cultures ……………………………………………………………………… 32 II. Mise en évidence de l'activité antimicrobienne ……………………………………….. 33 II.1. Les germes cibles………..………………………………………………………………. 33 II .2. Méthode de stries croisées…………………………………………............................. 34 II .3.Méthode des cylindres d’agar ………………………………..……………………….. 34 iii III. Etude taxonomique ………………………………………..…………………………… 35 III .1. Etude morphologique…………………………………….………………………......... 35 III .1.1. Caractéristiques culturales…………………………………………………………… 35 III .1.2. Caractéristiques micromorphologiques ……………….……...................................... 36 IV. Etude physiologique et biochimique …………………………………………………... 36 IV.1. Tests de sensibilité aux antibiotiques…………………….………….. ………………... 36 IV.2. Production de pigments mélanoïdes………….…………………………........................ 36 IV.3. Utilisation des composés glucidiques comme seules sources de carbone……………... 37 IV.4. Utilisation des acides gras…………….………………………………………………... 37 IV. 5. Utilisation des acides amines………………….............................................................. 37 IV.6. Croissance en présence d’inhibiteurs………………………………………………….. IV.6.1. Croissance en présence de phénol …………………………………………………… IV.6. 2. Croissance en présence d'Antibiotiques (amoxicillin et pénicilline)……………….. 37 37 37 IV.7. Hydrolyse de l'amidon.................…………..………….................................................. 37 IV.8. Hydrolyse de la gélatine………………..……………….……………………………... 37 IV.9. Hydrolyse de tyrosine ………………….………………………………........................ 38 IV.10. Hydrolyse de caséine de lait …………………………………………......................... 38 IV.11. Hydrolyse de Tween 80 ………………………………………................................. 38 IV.12. Recherche de catalase …………..…………………………….…............................ 38 IV.13. Production de sulfure d'hydrogène (H2S)…………………….………....................... 38 IV .14. Utilisation du citrate………………………………………..…………..................... 38 IV.15. Dégradation de l’urée……………………….……………………… .……………… 39 IV.16. Production d’indole ………………………….……………………………………….. 39 IV.17. Tests de sensibilité à divers agents physiques……….………………………………... IV.17.1. Croissance à différentes températures………………………………………………. IV.17.2.Croissance à différents pH ………………………………………………………... IV.17.3. Croissance à différentes concentration en NaCl……………………………………. 39 39 39 39 Chapitre III : Résultat et discussion I.1. Prélèvement des échantillons …………………………..……………………..................... 40 I.2. Isolement des actinobactéries ………………………………………..………………………… 40 II. Résultats de l’action antagoniste des isolats d’actinobactérie ………………………….. 42 II .1. Méthode de stries croisées ……………………………………………..................... 42 II .2. Méthode de disque d’agar ……………..…………………………………………….. 44 iv III. Etude taxonomique des souches sélectionnées.……………………………………….. 46 III.1. Etude des caractères morphologiques (Aspect cultural)…………………………..…... 46 III .1.1. Etude macroscopique………………………….…………………………………….. 46 III .1.2. Etude microscopique………………………………………………………………… 50 III .1.3. Coloration de Gram………..………………………………………............................ 53 IV.1. Etude physiologique …………………………………………………………………. 55 IV .1.1. Test de sensibilité aux antibiotiques……………………………………………….. 55 IV .1.2. Production de pigments mélanoides ………………………………………………… IV.1.3. Test croissance en présence d’inhibiteur …………………………........................... IV .1.4. Hydrolyse d'amidon……………………………………………………………….. IV. 1.5. Hydrolyse de gélatine……………………………………………………………….. IV. 1.6. Hydrolyse de la caséine de lait……………………………………………………… IV .1.7. Hydrolyse de tyrosine………………………………………………………………. IV .1.8. Hydrolyse de tween 80………………………………………………………………. IV .1.9. Recherche de catalase………………………………………………………………. IV .1.10. Production de sulfure d'hydrogène (H2S)…………………………….................... IV .1.11. Utilisation du citrate…………………………………………………..…………. IV .1.12. Dégradation de l'urée ………………………………………………………………. IV .1.13. Production d'indole………………………………………………………………… IV.2. Testes biochimiques……………………………………………………………………. IV. 2.1.Utilisation de composé glucidique comme seules sources de carbone……………... IV 2.2. Utilisation des acides aminés....................................................................................... IV.3. Etude physique…………………………………………………………………………. IV.3.1. Croissance à différents valeurs de températures……………………………………... IV.3.2. Croissance à différents valeurs de pH . ................ ............. ........................................ IV.3.3. Tolérance au chlorure de sodium .......... ................................................................... .... 56 57 57 58 58 59 59 60 61 61 62 62 63 63 63 65 66 66 67 V.Conclusion………………………………………………………………………………… 68 Références Bibliographiques. Annexes v Liste des abréviations ADN : Acide DésoxyriboNucléique. ARNr16S : Acide RiboNucléique codant pour la sous unité ribosomique 16S. ATCC: American Type Culture Collection. CaCO3 : carbonate de calcium. CFU : Unité Formant Colonie DO : Densité Optique. E. coli : Escherichia coli. Ech : Echantillon. FeSO4 7H2O : sulfate de fer sept fois hydraté. G + C : Guanine + Cytosine. GLM : Gélose à l’extrait de levure_extrait de malt. GN : Gélose Nutritive. KH2PO4 : phosphate monopotassique. K2HPO4 : phosphate dipotassique. HCl : Acide chlorhydrique. ISP : International Streptomyces Project. MA : Mycélium Aérien. MgSO4 7H2O : sulfate de magnésium sept fois hydraté.. MnCl2 4H2O : chlorure de manganèse quatre fois hydraté. MPPM: modified phenoxazinone production medium MS : Mycélium de Substrat. vi (NH4)2 SO4: sulfate d'ammonium. P/V : Poids/Volume. PCR : Reaction en Chaine par Polymerase PS : pigment soluble. Q.s.p : quantité suffisante pour. Rpm: rotation par minute. sp : species (espèce). Trs : Tours. RF : Rectus Flexibilis. µl : Microlitre. ZnSO4 7H2O : sulfate de zinc sept fois hydraté. DAP : Acide Diaminopélimiques vii Liste des figures Figure 1. Actinobactéries isolées sur milieu amidon caséine agar (a, c Photos des Boites des isolates actinobacteriens). (b, d Morphologie des colonies). individuelles……………………………………………………………………………….. 6 Figure 2. Classification du genre Streptomyces selon Bergy' Mannual of Systematic Bacteriology (2006).…………………...…………………………………………………… 9 Figure 3. Croissance abondante d’un isolat d'actinobacterie sur le milieu d'agar de caséine et amidon. .A. Mycélium aérien. B. côté Inverser d’une biote montrant le mycélium substrat.................................................................................................................................... 11 Figure 4. Micromorphologie des principaux genres d'actinomycètes………………………… 12 Figure 5. Types des chaînes de spores rencontrés chez les espèces de streptomyces………. 13 Figure 6. Mycélium du substrat avec des chaines de spores de streptomyces sur le milieu Amidon-Caséine incubée à 30°C /7 jours …………………………………………..……... 13 Figure 7. Organisation du gène codant pour l'ARNr 16S.……………………………….. 15 Figure 8. Schéma du cycle de vie de Streptomyces dans les conditions naturelles ……….. Figure 9. Cycle de vie des streptomyces…………………………………………………… 16 17 Figure 10. Morphologies rencontrées aux cours de cultures liquides de streptomyces……. 18 Figure 11. Hyphe végétatives et conidiospores de S.coelicolor, SI: spores immatures, BP: Bordure de la paroi, SM: spore matures…………………………………………………... 20 Figure 12. Développement du mycélium secondaire en spores ………………………… Figure 13. Applications biotechnologiques des actinobactéries…………………………... Figure 14. Antibiotiques d'actinobactéries............................................................................ Figure 15. Différents types d'enzymes produits par actinobacteria. une. amylase. B. Protéase. C. Lipase. La zone d'inhibition autour de l'inoculation actinobacteria confirme uploads/Geographie/ mimoir-feni.pdf