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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUP

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE -EL HADJ LAKHDER -BATNA FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE MEMOIRE Pour l’obtention du diplôme de MAGISTER En Biologie Option : Biochimie Appliquée Présenté par BOUZID Wafa THEME Devant le jury : Mme HAMBABA Leila M.C, Université de Batna Présidente Mr YAHIA Mouloud M.C, Université de Batna Rapporteur Mr LAROUI Salah M.C, Université de Batna Examinateur Mme ZAAMA Djamila M.C, Université de Constantine Examinatrice Mr YAHIA Abdelwahab M.C, Université d’Oum El Bouaghi Examinateur Année Universitaire : 2008/2009 Etude de l’Activité Biologique des Extraits du Fruit de Crataegus monogyna Jacq. Remerciements Je remercie tout d’abord ALLAH tout puissant de m’avoir donné la patience, la santé et la volonté pour réaliser ce mémoire. Je tiens particulièrement à remercier mon promoteur, Mr YAHIA Mouloud, Maitre de Conférences à l’université de Batna pour avoir accepté la charge d’être rapporteur de ce mémoire, je le remercie pour sa disponibilité, ses pertinents conseils et pour les efforts qu’il avait consentis durant la rédaction de ce mémoire. Je voudrais remercier Mr YAHIA Abdelwahab, Maitre de Conférences à l’université d’Oum El Bouagui, Mme ZAAMA Djamila, Maitre de Conférences à l’université de Constantine, Mr LAROUI Salah, Maitre de Conférences à l’université de Batna, pour avoir accepté d’évaluer ce travail en dépit de leurs nombreuses autres obligations. Un remerciement chaleureux à Mme HAMBABA Leila, responsable de la post graduation (Biochimie Appliquée) au département de Biologie université de Batna. Je ne saurais jamais la remercier assez pour son aide, sa disponibilité, son soutient sans faille et sa sympathie. Je présente mes remerciements à Mr ABDEDDAIM Mohamed, chargé de cours à l’université de Batna, pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et de m’avoir suivi et encourager à ne pas baisser les bras dans les moments difficiles. J’aimerais également exprimer ma gratitude à Mr ABERKANE Mohamed Cherif, Maitre de Conférences à l’université de Batna et à Mr AYACHI Amar, chargé de cours à l’université de Batna, pour leurs précieuses aides, je les remercie également pour m’avoir accueilli au sein de leur laboratoire et de m’avoir fait profiter de leurs compétences. Merci pour tous ceux et celles qui m’ont aidé d’une façon ou d’une autre dans mon travail : Mr BELKACEMI M, Mr BELKACEMI S, Mr BOUSSELSLA H, Mr MERADI S, je les remercie du fond du cœur. Je remercie tendrement ma famille, ma belle famille et mes proches amies qui m’ont toujours soutenues et encouragée même dans les périodes les plus difficiles, merci pour votre soutient inépuisable. Liste des abréviations AAR : Activité antioxydante relative. ADN : Acide desoxyribonucleique. ANOVA : Analysis of variance. APR : Pouvoir antiradicalaire. ARN : Acide ribonucléique. BHT : Hydroxy toluene butylé. CCM: Chromatographie sur couches minces. CLHP : Chromatographie liquide à haute performance. DL50 : Dose létale à 50%. DPPH : Diphenyl picryl- hydrazyle. EAG : Equivalent d’acide gallique. EAq : Extrait aqueux du Crataegus monogyna. EC : Equivalent de catéchine. EC50 : Concentration effective à 50%. EDm : Extrait dichloromethane de Crataegus monogyna. EEp : Extrait etheropetrolique de Crataegus monogyna. EMe : Extrait methanolique de Crataegus monogyna. ERO : Espèces réactives de l’oxygène. EQ : Equivalent de quercetine. GPx : Glutathion peroxydase. GSH : Glutathion. H2O2 : Peroxyde d’hydrogene. IC50 : Concentration inhibitrice à 50%. LDL : Low Density Lipoprotein. RL: Radical libre. RLs: Radicaux libres. Rf : Rapport frontal. S.aureus : Staphylococcus aureus. SD : Standard deviation. SOD : Superoxyde dismutase. UV : Ultra Violet. Sommaire Introduction Etude bibliographique I.1. Etymologie……………………………………………...………..…..................... 1 I.2. Origine………………………………………………………………..…………… 1 I.3. Description botanique……………………………………...................................... 1 I.4. Exigences climatiques …………………………………………………………… 2 1.5. Position dans la systématique……………………………………………………. 2 I.6. Aires de répartition………………………………………………………………… 3 I.7. Chimie de la plante …………………………………………………………......... 3 I.7.1 Composition en métabolites primaires…………………………………………… 3 I.7.2. Composition en métabolites secondaires………………………………………… 5 I.8. Données pharmacologiques……………………………………………………..… 6 I.9. Toxicité………………………………………………..…...................................... 7 II.1. Définition d’un radical libre…………………………........................................... 9 II.2. Différents type des ERO……………….…........................................................... 10 II.3. Stress oxydant………………………………………............................................ 11 II.4. Les antioxydants………………………………………………………………… 12 II.5. Mécanismes physiologiques de l’inactivation des ERO………………………… 12 II.5.1. Système de défense primaire…………………….............................................. 12 II.5.2. Système de défense secondaire……………....................................................... 13 Chapitre I Données Générales sur l’Aubépine monogyne Chapitre II Oxydation et Antioxydants III.1.Généralités……………………………….............................................................. 16 III.2. Les coumarines …………………………............................................................. 17 III.2.1. Activités biologiques et intérêts pharmacologiques des coumarines…………. 18 III.2.2 Toxicité des coumarines ……………………………………………...……....... 19 III.3. Les flavonoïdes…………………………………………………………….......... 20 III.3.1. Activité biologique et intérêt pharmacologiques des flavonoïdes……………... 21 III.4.Les tanins…………………………………………................................................ 24 III.4.1. Activité biologique et intérêt pharmacologiques des tanins………………… 25 Etude expérimentale IV.1. Matériel végétal……..…………………………………………………………… 29 IV.2. Méthodes analytiques……………………………............................................... .30 IV.2.1. Détermination de la teneur en eau……………………………………………. 30 IV.2.2. Détermination de la teneur en cendres totales……........................................... 30 IV.2.3. Teneur en substances extractibles par l’eau ………................................. …… 31 IV.2.4. Teneur en Substances extractibles par l’éthanol ….......................................... 31 IV.2.5. Extractions……………………………………...…......................................... 31 IV.2.5.1. Extraction par macération à l’eau ………………………………..……….... 31 IV.2.5.2. Extraction avec les solvants organiques………............................................. 32 IV.2.6. Réactions de caractérisation…………………................................................ 33 IV.2.6.1. Recherche des alcaloïdes………………………………………………..….. 33 IV.2.6.2. Recherche des composés phénoliques ………………………………..….... 34 IV.2.7. Analyse chromatographique ………………………………………..………. 35 IV.2.7.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) ………………………..……… 35 IV.2.7.2. Chromatographie liquide à haute performance (CLHP) ................................ 36 IV.2.8. Dosage spectrophotometrique……… ………………………………….……. 37 Chapitre III Métabolites Secondaires Chapitre IV Matériel et Méthodes IV.2.8.1. Estimation quantitative des polyphénols totaux……………………….…… 37 IV.2.8.2.Estimation quantitative des flavonoïdes totaux……....................................... 37 IV.2.8.3. Estimation quantitative des Tanins condensés….......................................... 37 IV.2.9.Tests biologiques………………………………................................................ 38 IV.2.9.1. Evaluation, in Vitro, de l’activité antioxydante ………………………..… 38 IV.2.9.1.1.Test de blanchissement du β-carotène …………………………………..... 38 IV.2.9.1.2.Test au DPPH……………………………………………………………… 39 IV.2.9.2. Evaluation de l’activité antimicrobienne…………………………………… 40 IV.3. Analyses statistiques……………………………………………………………. 41 V.1. Détermination de la teneur en eau, en cendres totales et en substances extractibles par l’eau et par l’éthanol………………………………………43 V.2. Extractions………………………………………………………………………. 44 V.3. Réactions de caractérisation………………………………................................... 45 V.4. Analyse chromatographique…………………………………………………...... 46 V.4.1. Chromatographie sur couches minces (CCM)……………………………….... 46 V.4.2 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)………………………. 49 V.5. Dosage spectrophotometrique…………………………………………………… 53 V.5.1. Dosage des polyphénols totaux, des flavonoïdes totaux et des tanins condensés……………………………………………................................................. 53 V.6.Tests biologiques………………………………………………………………… 56 V.6.1. Evaluation de l’activité antioxydante…………………………………………..……... 56 V.6.1.1. Test de blanchissement du β carotène…………….…………………………. 56 V.6.1.2.Test au DPPH………………………………………………………………… 59 V.6.2. Evaluation de l’activité antimicrobienne…………………………..………... 62 Conclusion et Perspectives Chapitre V Résultats et Discussion Références Bibliographiques Liste des tableaux 01 Constituants chimiques de la partie comestible du Crataegus monogyna……….. 3 02 Composition chimique de la partie charnue du Crataegus monogyna…………… 4 03 Propriétés chimiques de l’aubépine « Crataegus spp »…………………………. 5 04 Teneur en eau, en cendres totales et en substances extractibles par l’eau et par l’éthanol………………………………………………………………………….. 43 05 Masse, rendement et couleur des extraits obtenus………………………………. 44 06 Les composés que pourraient contenir les différents extraits préparés…………… 45 07 Résultats des réactions en tubes sur les extraits préparés……………………….. 45 08 Rapports frontaux(Rf) des spots issus de la séparation des extraits EEp et EDm dans le système hexane/ether diéthylique(1 :1) ………………………………… 46 09 Rapport frontaux(Rf) des extraits EMe et EAq dans le système BAW (60 :15 :35)………………………………………………………………………. 48 10 Rapports frontaux des temoins dans le système BAW (60 :15 :35)……………… 48 11 Temps de rétention des témoins…………………………………………………. 50 12 Temps de rétention des pics issus des extraits…………………………………… 50 13 Résultats du dosage des polyphénols totaux, des flavonoïdes et des tanins dans les extraits de Crataegus monogyna………………………………………………….. 55 14 Activité antiradicalaire des extraits de Crataegus monogyna……………………… 59 15 Résultats de l’antibiogramme (diametres des zones d’inhibition de croissance bactérienne mm)…………………………………………………………………. 63 16 Activité antimicrobienne de l’EEp (diamètres des zones d’inhibition de croissance des cultures microbiennesen mm)…………………………………… 64 17 Activité antimicrobienne de l’EDm (diamètres des zones d’inhibition de croissance des cultures microbiennes en mm)…………………………………… 65 18 Activité antimicrobienne de l’EMe (diamètres des zones d’inhibition de croissance des cultures microbiennes en mm)…………………………………… 66 19 Activité antimicrobienne de l’EAq (diamètres des zones d’inhibition de croissance des cultures microbiennes en mm)…………………………………… 67 20 Activité antimicrobienne des extraits flavoniques (diamètres des zones d’inhibition de croissance des cultures microbiennes en mm…………………… 70 Liste des figures 01 Fruit, fleurs et feuilles de Crataegus monogyna Jacq………………………… 2 02 Réaction de détoxification du radical-anion superoxyde et du peroxyde d’hydrogène………………………………………………………………….. 13 03 Squelette de base des coumarines……………………………………….……. 17 04 Définition des différents types de flavonoïdes à partir du squelette flavane….. 21 05 Structure des tanins condensés…………………………………………….…. 25 06 Représentation des différentes parties de Crataegus monogyna………………. 29 07 Schéma d’extraction par macération à l’eau………………………………...... 32 08 Schéma d’extraction par épuisement successif par les solvants organiques…. 33 09 Chromatographie sur couche mince des extraits EEp et EDm……………….. 47 10 Chromatographie sur couche mince des extraits EMe et EAq……………….. 49 11 Chromatogramme de la quercetine…………………………………………... 51 12 Chromatogramme de la Rutine……………………………………………….. 51 13 Chromatogramme de la Catéchine……………………………………….…… 51 14 Profil chromatographique de l’EAq………………………………………….. 52 15 Profil chromatographique de l’EMe………………………………………….. 52 16 Profil chromatographique l’EDm…………………………………………...... 52 17 Profil chromatographique de l’EEp………………………………………….. 53 18 Droite d’étalonnages de l’acide gallique……………………………………… 54 19 Droite d’étalonnages de la quercetine………………………………..………. 54 20 Droite d’étalonnages de la catéchine…………………………………………. 54 21 Cinétique de blanchissement du β carotène à 490nm en absence et en présence des extraits de Crataegus monogyna et du BHT……………………………… 58 22 Activité antioxydante relative des extraits et du BHT dans le système β carotène/acide linoléique……………………………………………………... 59 23 Activité antiradicalaire des extraits de Crataegus monogyna………………... 61 24 Activité antiradicalaire de l’antioxydant de référence (BHT)………………… 62 25 uploads/Geographie/ etude-activite-biologie-extrait-fruit-pdf.pdf