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Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB. 1 FICHE TECHNIQUE N°11 :

Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB. 1 FICHE TECHNIQUE N°11 : Dénombrement des Pseudomonas sur gélose au Cétrimide. Gélose au Cétrimide : Milieu sélectif destiné à l’isolement et au dénombrement de Pseudomonas aeruginosa dans les produits biologiques d’origine animale, les produits pharmaceutiques, alimentaires et cosmétiques. Composition : Pour litre de milieu : o Peptone ……………………………………………….………………… 20 g. o Chlorure de magnésium (agent différentiel) …………………...…. 1.4 g. o Sulfate dipotassique (agent différentiel) ..……………………...……. 10 g. o Cetrimide : cetyltrimethylammonium bromide (agent sélectif) . 0.3 g. o Glycérol ………………………………………………………….………. 10 g. o Agar ……………………………………………………………………. 13.6 g. pH du milieu prêt – à - l’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2. Principe : Le cétrimide (bromure de cétyl-triméthyl-ammonium), composé ammonium quaternaire, agit comme inhibiteur d’une grande variété de germes, y compris les espèces de Pseudomonas autres que Pseudomonas aeruginosa. La production de pyocyanine (pigment bleu, non fluorescent, soluble dans l’eau et le chloroforme) est stimulée en présence de chlorure de magnésium et de sulfate de potassium. Le milieu favorise également la production de pigments fluorescents (pyoverdines) par certaines souches de Pseudomonas aeruginosa. La plupart des Pseudomonas aeruginosa sont identifiables à leur odeur d’aminoacétophénone. Technique : 1) Préparation des dilutions décimales : voir fiche technique 1. 2) Ensemencement en surface (en nappe) : voir fiche technique 5. 3) Incubation : incuber à 30-35 ± 1°C pendant 24 ± 2h. 4) Lecture : 5) Pseudomonas aeruginosa présente des colonies pigmentées en jaune-vert fluorescentes sous rayons ultra-violets à 254 nm. 6) Dénombrement : Compter les colonies typiques sur les boîtes contenant entre 15 et 150 colonies. Faire la moyenne des trois boîtes pour la même dilution. Appliquer la loi de Kass : N = m x 1/V x 1/D (UFC/ml). N : le nombre d’unités formant une colonie de P. aeruginosa. m : la moyenne des boîtes. V : le volume ensemencé. D : la dilution correspondant aux boîtes choisies. Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB. 2 1 ml 1 gr 1 ml Dilution 10-1 Dilution 10-2 Dilution 10-3 Incubation 37°C 24 h 5 UFC 3 UFC 7 UFC 75 UFC 61 UFC 65 UFC 615 UFC 596 UFC 589 UFC yaourt 9 ml TSE 0,1 ml . . . . . . . … . . .. . . . m1 = 600 UFC m2 = 67 UFC m3 = 5 UFC Préparation des dilutions décimales Ensemencement (en surface) Comptage Des colonies Dénombrement Appliquer la loi de Kass N = m x 1/V x1/D. Choisir la moyenne située entre 15 et 150 colonies : 15 < m2 <150. La dilution qui correspond à la série de tubes de m2 est 10-2 . Le volume ensemencé V =0,1 ml. N = 67 x 0.1/1 x 1/10-2 N = 67.103 UFC de P. aeruginosa /gr (ou ml). Confirmation : test de coagulase uploads/Geographie/ ft-12-denombrement-pseudo.pdf