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Microbiologie /Univ. de Blida1 ; Faculté SNV. Pr Meklat Atika et Dr Debib Aicha

Microbiologie /Univ. de Blida1 ; Faculté SNV. Pr Meklat Atika et Dr Debib Aicha (2019-2020) 1 5. Croissance des bactéries 1. Introduction Chez les microorganismes unicellulaires, la croissance conduit à une augmentation du nombre d’individus c’est donc l’équivalent d’une multiplication. Le milieu liquide constitue le milieu favorable à l’étude de la croissance bactérienne. 2. Méthodes de mesure de la croissance bactérienne Les techniques de mesure de la croissance sont basées sur l’évaluation du nombre de bactéries ou de leur masse par unité de volume ou de poids du milieu. On peut dans certains cas utiliser des méthodes indirectes en mesurant un paramètre lié à l’activité métabolique : consommation d’un substrat, une molécule excrétée dans le milieu, etc… 1. Mesure du nombre de cellules C’est la détermination de la concentration cellulaire exprimée en nombre de bactéries par unité de volume 1.1. Lecture au microscope (numération totale) : technique couramment utilisée pour les bactéries, les levures et les spores de mycètes. On se sert d’un hématimètre de Malassez ou de la cellule de Thoma. Il s’agit d’une lame en verre dont l’une des faces est creusée d’une cavité de profondeur connue et dont le fond porte des quadrillages de surface également connue. La suspension bactérienne est placée dans la cuvette puis recouverte d’une lamelle. Des volumes précis sont ainsi délimités au niveau des quadrillages dans lesquels les cellules sont comptées au microscope. Le nombre de microorganisme dans un échantillon est calculé en tenant compte du volume de la chambre et de la dilution de l’échantillon. Pour obtenir des résultats fiables la population microbienne doit être suffisamment dense. On note aussi que cette méthode prend en compte toutes les cellules aussi bien mortes ou vivantes. 1.2. Dénombrement après culture (numération viable) 1.2.1. Dénombrement en milieu solide : le dénombrement des bactéries viables est une méthode communément utilisée. Un volume fixe (0,1 à 1 ml) de la culture mère ou des dilutions décimales (préparées à partir de la solution mère) est étalé à la surface d’un milieu gélosé ou incorporé au milieu avant sa solidification. Après incubation à une température convenable, le nombre de colonies Microbiologie /Univ. de Blida1 ; Faculté SNV. Pr Meklat Atika et Dr Debib Aicha (2019-2020) 2 apparues correspond au nombre d’unités formant une colonie (UFC) présentes dans le volume analysé de la suspension. La suspension doit être homogène et ceci par agitation mécanique. ➢ Expression des résultats : Le nombre de colonies retenu après lecture des boîtes devra être compris entre 30 et 300. Il est impossible de compter une boite contenant plus de 300 colonies. Le risque d'erreur est trop important donc elles sont écartées. Les boites contenant moins de 30 colonies sont elles aussi écartées, les colonies sont trop rares et peuvent induire en erreur. Exemple : 1.2.2. Dénombrement en milieu liquide ( Méthode du nombre le plus probable (NPP ou MPN Most Probable Number en anglais), méthode statistique utilisée pour le dénombrement de microorganismes en milieu liquide. Microbiologie /Univ. de Blida1 ; Faculté SNV. Pr Meklat Atika et Dr Debib Aicha (2019-2020) 3 Si les conditions optimales de croissance sont réunies, un seul micro-organisme présent dans l’inoculum introduit dans un milieu liquide se développe en y créant un trouble (et une modification visible du milieu si celui-ci est discriminatif). La lecture des tubes contenant le milieu liquide et ensemencés avec l’inoculum est donc de type binaire : ➢ résultat négatif si absence de trouble et de modification du milieu : il y avait moins de un micro- organisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide ➢ résultat positif si présence de trouble (et de modification du milieu si celui-ci est discriminant) : il y avait au moins un micro-organisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide. On ensemence donc une série de tubes avec un volume donné du produit à analyser ou ses dilutions, à raison de 1, 2, 3, 5 tubes par dilution testée. Connaissant le nombre de résultats positifs obtenus dans la série de tubes, on peut déterminer le nombre caractéristique Mise en place du nombre caractéristique Le nombre caractéristique de la série réalisée est une combinaison de trois chiffres : --chaque chiffre correspond au nombre de tubes « positifs » pour une dilution donnée ; --les trois chiffres correspondent à trois dilutions successives ; --le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilution (donc à la plus forte concentration en micro-orga- nismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire et celui des unités à la plus grande dilution. --On reporte le nombre caractéristique de la série dans la table statistique de Mac Grady Exemple : Exemple : 321 correspond au NPP de 15. Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries dans l’inoculum de la dilution 10-3 Expression du résultat N : nombre de micro-organismes par ml de produit analysé ou de suspension mère. NPP : le nombre lu dans la table de Mac Grady. K : facteur de dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique. V : volume de l’inoculum (1ml en général) 2.Mesure de la masse : 2.1. Détermination du poids sec : les microorganismes sont récoltés par centrifugation ou par filtration sur membrane d’un volume fixe. Après lavage soigneux, le culot ou le filtre est séché à 100- Microbiologie /Univ. de Blida1 ; Faculté SNV. Pr Meklat Atika et Dr Debib Aicha (2019-2020) 4 110 °C jusqu’à poids constant que l’on exprime généralement en gramme de matière sèche/ litre. Cette méthode est très longue et peu sensible. Elle est utilisée surtout pour les levures et les mycètes. 2.2. Mesure du trouble : c’est le procédé le plus utilisé pour évaluer la masse microbienne. Il s’agit d’une méthode optique générale, basée sur la propriété que présente toute solution d’absorber une partie de l’intensité d’un faisceau de lumière qui la traverse en ligne droite. Des appareils spéciaux, comme le spectrophotomètre qui donne directement la valeur de cette absorbance à une longueur d’onde de 650 nm. Dans le cas ou la valeur de la DO dépasse 0,6 on doit diluer l’échantillon analysé pour rester dans le domaine linéaire de la loi de Beer Lambert. Loi de Beer Lambert : DO = Log I0 / It = K . C . l DO = Densité optique = A = absorbance I0 = intensité de lumière incidente It = intensité de lumière transmise K = coefficient d’extinction L = le trajet optique = 1 cm. C = la concentration en cellules Cette méthode ne peu pas être utilisée dans le cas de bactéries productrices de pigments diffusibles. 3. Constantes et expression mathématique de la croissance en discontinue (ou en BATCH) Dans la culture en milieu bacth les éléments nutritifs ne sont pas renouvelés, la phase de croissance ne dure que quelques heures. La croissance d’une bactérie placée dans des conditions idéales de culture peut être définie par deux constantes : le temps de génération et le taux de croissance. 3.1. Temps de génération (G) : C’est l’intervalle de temps entre deux divisions successives ou celui nécessaire au dédoublement de la population. Si nous partons d’une cellule bactérienne unique, son accroissement se fait selon une progression géométrique : 1→ 2→ 4→ 8, etc. Le temps de génération (G) est donc le temps nécessaire au doublement de la population en minutes ou en heures. G = t / n t = temps (connu) n = nombre de divisions Microbiologie /Univ. de Blida1 ; Faculté SNV. Pr Meklat Atika et Dr Debib Aicha (2019-2020) 5 3.2. Taux de croissance (µ): On le définie comme étant le nombre de divisions par unité de temps : µ = n/t t = temps (connu) n = nombre de divisions 3.3. Expressions mathématique de la croissance Si on une population bactérienne à une concentration initiale N0 elle augmente à chaque génération de la façon suivante : Après 1 génération : N1 = 2N0 2 générations : N2 = 2N1 = 2 x 2N0 = 22 N0 3 générations : N3 = 2N2 = 2 x 2 x 2N0= 23 N0 n générations : Nn = 2n x N0 ……………….(1) On a µ = n / t donc n = µt……………………….(2) Si on remplace la formule 2 dans la formule 1 on trouve : Nn = 2 µt x N0 2 µt = Nn / N0……………………(3) Si On prend la forme logaritmique à base de 2 de la formule 3 : Log2 2 µt = Log2 Nn / N0 µt = Log2 Nn / N0 µt = Log2 Nn - Log2 N0 Log2 Nn = µt + Log2 N0 y = ax + b 4. Courbe de croissance La représentation graphique de la croissance s’effectue en coordonnées semilogarithmique. Le nombre ou la masse bactérienne étant traduit en nombre logarithmique sur l’ordonnée, le temps en nombre arithmétique sur l’abscisse. Le graphe log N = f(t), permet une exploitation précise de la phase de croissance car elle est linéaire. Cette courbe permet de déterminer plus précisément les paramètres de la croissance. On distingue six phases : Microbiologie /Univ. de Blida1 uploads/Geographie/ croissances-des-bacteries.pdf