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Université Alger 1 Benyoucef BENKHEDDA SNV/ L2 Mme BENBAIBECHE. H. 1 Génétique

Université Alger 1 Benyoucef BENKHEDDA SNV/ L2 Mme BENBAIBECHE. H. 1 Génétique bactérienne De nombreuses découvertes en génétique moléculaire résultent de travaux menés chez les bactéries et les bactériophages (virus appelés phages, ayant pour hôte les bactéries). I. Généralités Une bactérie est un microorganisme unicellulaire procaryote, sa taille varie de 1 à 10 microns. Possédant un seul chromosome sous forme circulaire en général (exemple : Escherichia coli). L'ADN chromosomique est constitué d'une double hélice pelotonnée, surenroulée dans le cytoplasme. L'analyse chimique de l'appareil nucléaire indique qu'il est composé à 80 % d'ADN (le chromosome), à 10 % d'ARN (rôle de structuration) et à 10 % de protéines. A côté du chromosome, support de l'hérédité, la bactérie peut contenir des éléments génétiques (ADN) de petite taille (0,5 à 5 % du chromosome bactérien), extra-chromosomiques, appelés plasmides. La bactérie se divise par scissiparité (bipartition), une cellule donne 2 cellules toutes les 20 min. Remarque : des exceptions sont retrouvées chez les spirochètes (Treponema, Borrelia, Leptospira), où le chromosome est linéaire. Les bactéries du genre Brucella possèdent deux chromosomes. I.1 Besoins nutritifs Besoins constitutifs : - élémentaires ; C, H, O, N, essentiellement à partir d’un sucre ; - spécifiques ; facteurs de croissance pour certaines bactéries ; - besoins énergétiques couverts par des réactions d’oxydo-réduction Les bactéries peuvent se développer soit dans un milieu de culture liquide, soit semi-solide d’agar dans des boites de Pétri. Si les composants du milieu contiennent une source de carbone (fructose ou lactose..) et une variété d’ions; Na+, K+, Mg++, Ca++ et NH4 + sous forme de sels inorganiques, le milieu est appelé milieu minimum. Pour se développer sur un tel milieu, une bactérie doit être capable de synthétiser tous les composés organiques essentiels (acides aminés, vitamines, acides gras..), elle est dite prototrophe, de type sauvage. Ces bactéries forment des colonies sur un milieu minimum ; eau + sels minéraux + glucose (Eau + sels minéraux =milieu minéral). La bactérie a besoin d’azote (N) pour la synthèse d’acides aminés, il est d’origine minérale puisé dans le milieu de culture. Souche sauvage : souche isolée en milieu naturel, n’ayant subit aucun traitement par les mutagènes, ni manipulations génétiques, souvent naturellement prototrophe. E. coli K-12 est considérée comme souche sauvage. Elle est prototrophe, capable de cataboliser beaucoup de sucres, sensible à la majorité des bactériophages, thermorésistante (croissance jusqu’à 45°C), non pathogène, sensible à la majorité des antibiotiques. Si la bactérie, perd par mutation, la capacité de synthétiser un ou plusieurs composés organiques, elle devient auxotrophe. Université Alger 1 Benyoucef BENKHEDDA SNV/ L2 Mme BENBAIBECHE. H. 2 I.2 Mutations La mutation est un changement, spontané ou provoqué par un agent mutagène, héréditaire (stable), brusque (discontinu), rare (10-6 à 10-9) et indépendant dans les caractères d'une bactérie, et qui est lié à une modification du génome bactérien (ADN). La mutation peut être réversible (mutation réverse). I.2.1. Nutritionnelle Elle inactive les voies de biosynthèse et engendre un mutant auxotrophe, incapable de se développer sur un milieu minimum. Exemple : une souche bactérienne prototrophe pour l’histidine, possède sur son chromosome le gène his+, la souche mutée perd la capacité de synthétiser l’histidine et le gène devient his-, l’acide aminé doit être ajouté en supplément au milieu pour qu’elle puisse se développer. Un milieu supplémenté est appelé milieu complet. I.2.2. Source de carbone Exemple : une souche bactérienne qui dégrade le galactose à un gène Gal+, on lui fournit ce sucre dans le milieu de culture. La souche mutée perd la capacité de dégrader ce sucre, on ne le met pas dans le milieu de culture, on lui met le glucose qui peut être dégradé par toutes les souches bactériennes. I.2.3. Résistance à un antibiotique La souche sauvage est sensible aux antibiotiques, aux phages et aux poisons. Certains mutants peuvent acquérir une résistance. Si la cible de l’antibiotique est une enzyme, la mutation au niveau du gène codant pour cette enzyme peut entraîner une diminution voire une suppression de l’affinité de l’antibiotique pour l’enzyme (modification de cible). Cas de la résistance des Staphylococcus aureus à la méticilline. Exemples -Une souche sensible à la streptomycine, possède un gène strs, suite à une mutation son gène devient strr ; -Une souche sensible au phage T4, possède un gène T4s, suite à une mutation son gène devient T4r. I.3. Sélection des souches I.3.1. Milieux sélectifs Un milieu sélectif est un milieu de culture favorable au développement d’une seule souche. On peut utiliser un sucre, un acide aminé ou encore un facteur de croissance pour rendre le milieu sélectif. On fait recours aussi aux : phage, antibiotique et poison (partie TD). I.3.2. Technique de réplique sur velours (Joshua et Esther Ledberg, 1952) - Origine moléculaire des mutations spontanées Une population de bactéries est étalée sur un milieu non sélectif -sans phage- et une colonie se développe à partir de chaque cellule. Un morceau de velours stérile est appuyé légèrement contre la surface de la boite matrice et le velours fixe des cellules dès qu’il y a une colonie (figure 1). Université Alger 1 Benyoucef BENKHEDDA SNV/ L2 Mme BENBAIBECHE. H. 3 Figure 1 La technique de réplique sur velours. Elle permet d’identifier les colonies mutantes sur une boîte matrice, d’après le comportement sur des boîtes contenant un milieu sélectif. (G.S. Stent et R, Calendar, Molecular Genetics, 2° éd. W. H. Freeman and Company, 1978.) De cette façon le velours porte une «empreinte» des colonies présentes en contact avec des boîtes répliques contenant un milieu sélectif (càd des phages T1). Lors du contact entre le velours et les boîtes répliques, les cellules présentes sur le velours sont inoculées dans ces boîtes répliques aux mêmes positions relatives que leurs colonies d’origine dans la boîte matrice. De rares colonies mutantes furent observées sur les boîtes répliques, mais les multiples boîtes répliques présentaient des motifs identiques de colonies résistantes (figure 2). Série de boîtes répliques contenant des concentrations élevées de phage T1 et quatre colonies Tons La technique de réplique sur velours permet de démontrer la présence de mutants avant la sélection Figure 2 Ce sont les mêmes colonies qui apparaissent sur les trois répliques, ce qui prouve que les colonies résistantes existaient sur la boîte matrice, (D’après G. S. Stent et R. Calendar, Molecular Genetics, 2° éd. W. H. Freeman and Company, 1978.) Université Alger 1 Benyoucef BENKHEDDA SNV/ L2 Mme BENBAIBECHE. H. 4 Si les mutations étaient apparues après l’exposition aux agents sélectifs, les motifs de colonies observés sur les boites auraient été aussi aléatoires que les mutations. Par conséquent, on a pu conclure que les événements mutationnels se sont produits avant l’exposition à l’agent de sélection. La mutation est un processus aléatoire. N’importe quel allèle d’une cellule peut être touché à tout moment. II. Transferts de matériel génétique : parasexualité chez les bactéries La bactérie peut être l'objet de variations génétiques autres que la mutation. Celles-ci peuvent résulter du transfert de matériel génétique d'une bactérie à une autre par des processus aussi différents que la conjugaison, la transformation et la transduction. Chez les Procaryotes, les transferts génétiques sont unidirectionnels. Un fragment de matériel génétique exogène pénètre dans une cellule receveuse. Cet ADN peut persister dans le cytoplasme (cas de nombreux plasmides) ou être intégré au chromosome bactérien par recombinaison. II.1. Conjugaison bactérienne (Joshua Ledberg et Edward Tatum, 1946) Les expériences ont été menées chez deux souches multi-auxotrophes (mutants nutritionnels) de la souche E. coli K12. La souche A requiert la présence de méthionine (met) et de biotine (bio) pour se développer, alors que la souche B requiert la présence de thréonine (thr), de leucine (leu) et de thiamine (thi). Les deux souches ne peuvent pas se développer sur un milieu minimum.  les souches sont d’abord mises séparément sur des milieux supplémentés différemment, puis ;  les cellules sont mélangées et mises en culture pendant plusieurs génération, enfin ;  elles sont étalées sur milieu minimum (figure 3). Recombinaison génétique : remplacement d’un ou plusieurs gènes présents dans une souche par ceux d’une souche génétiquement distincte. L’information génétique d’un chromosome est transférée sur un autre chromosome, entraînant la modification du génotype. Université Alger 1 Benyoucef BENKHEDDA SNV/ L2 Mme BENBAIBECHE. H. 5 Figure 3 La recombinaison génétique entre deux souches auxotrophes. Les prototrophes apparaissent avec un taux de 10-7. Ledberg et Tatum suggèrent l’existence de recombinaison génétique. II.1.1. Nature physique et base génétique de la recombinaison - Le transfert du matériel génétique est unidirectionnel. Quand les cellules sont donneuses d’ADN elles sont appelées F+ (F pour fertilité ou facteur sexuel) ou bactéries mâles ; - Les bactéries réceptrices reçoivent et recombinent cet ADN avec une partie de leur propre chromosome, sont appelés F- ou bactéries femelles. Expérience de Bernard Davis (1950) Les cellules F+ et F- ont été cultivées dans un tube en forme de U. à la base du tube est inséré un filtre de verre avec des pores permettant le passage du liquide mais pas celui des bactéries. Les cellules F+ sont placées d’un côté du filtre, les cellules F- de l’autre (figure 4). Université Alger 1 uploads/Geographie/ genetique-bacterienne 2 .pdf