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TP 1 : Isolement et purification d’entérobactérie à partir d’un échantillon de

TP 1 : Isolement et purification d’entérobactérie à partir d’un échantillon de sol Microflore de sol : contient des bactéries, archaebactéries, champignons (levures & moisissures), algues et protozoaires. L’isolement : consiste à réaliser à partir d’un échantillon des suspensions-dilutions. Ces dernières sont ensemencées sur milieu de culture solide. Au terme d’incubation, les germes contenus dans le sol seront développés. Chaque germe sera à l’origine d’une colonie, le comptage des colonies permet par méthode de calcul simple d’estimer la quantité de germes contenue dans le sol étudié. L’utilisation d’un milieu sélectif comme le milieu EMB permettra le criblage des bactéries à G- présentes dans l’échantillon de sol, leur isolement, et leur purification. Isoler : sélectionner (choisir, mettre à part) un microorganisme pour faire une étude (recherche). Milieu EMB : - Il permet le criblage des bactéries à Gram- (entérobactéries). - Il va servir à la présélection des souches isolées d’entérobactéries. Milieu sélectif pour les entérobactéries. - Il contient inhibiteurs des Gram-. Défavorise la croissance des Gram+ (sont éliminés). Milieu GN (incliné): - Milieu standard. - Favorable pour tous les microorganismes. - Il va servir à une multiplication non sélective des bactéries. Entérobactérie : AAF, Gram -, bacille, mobile, catalase+, oxydase -. Les étapes : PECDEDL 1- Isolement primaire : - Prélèvement : pour déterminer la flore présente dans le sol, on va fait de prélèvement d’un échantillon de terre afin de limiter l’apport d’autres contaminants. Il faut maintenir des conditions stériles. - Extraction : préparation de la solution mère = suspension bactérienne. deux fois 5g. 5g dans le four pasteur pour déterminer le poids sec. 5g dans un mortier avec 30 mL de l’eau physiologique  broyer  mettre dans l’éprouvette  compléter l’éprouvette à 50 mL  vortexer. - Calcul du poids sec : on place une masse au fout pasteur pendant un temps minimum de 6h à 180°. On s’affranchira du taux d’hydratation de la terre qui varie en fonction des conditions atmosphériques et du lieu de prélèvement. Ceci est nécessaire pour comparer des échantillons prélevés à des lieux différents, puisqu’on ne prend plus en compte que la masse de terre sèche. Pour être homogène, il y a différence d’humidité, déshydrater de l’échantillon. - Dilutions : pour diminuer la charge. On n’utilise pas la solution mère, parce qu’elle est riche et pleine de microorganisme, dans l’ensemencement elles vont former un tapis. de 10-1 à 10-8, transférer 1 mL de la suspension préparée. Dans le premier tube contenant 9 mL d’eau physiologique qui constitue la dilution 10-1. - Ensemencement : un étalement de 0.1 mL sur les milieux Le milieu GN : o Milieu standard (classique). o Permet la croissance de toutes les bactéries. o Va servir à une multiplication non sélective des bactéries. Le milieu EMB : o Milieu sélectif pour les entérobactéries : parce qu’il contient des inhibiteurs, favorise la croissance les G-, défavorise les G+. o Contient deux agents sélectifs (Eosine & Bleu de méthylène). o Permet d’inhiber les grams positifs. o Va servir à la présélection des souches isolées d’entérobactéries. - Dénombrement : il faut considérer que chaque colonie ou clone visible correspond à un microorganisme déposé sur la boîte lors de l’étalement. On utilise le terme UFC parce qu’on ne peut considérer que chaque clone provient d’une seule cellule originelle. Dénombrement grâce à un compteur de colonies. Chaque colonie issue dans d’une espèce bactérienne (clone), nombre quantitatif (on peut comptabiliser). Il faut un intervalle (significatif), colonies séparées (boite aérée=espace entre les colonies), nombre minimum. (On fait 3 fois pour confirmer). Nombre présentatif. Compteur de colonie : contient une loupe pour agrandir, tu appuies et il comptabilise  donne nombre précise, l’unité UFC (unité formant colonie). Les caractéristiques communes d’entérobactéries : o Bacille o AAF o Fermente le glucose o Catalase + o Oxydase - o Nitrate réductase + Agar : pour rendre le milieu solide Après comptage, exprimer le nombre de bactéries par un gramme. Faire une matière sèche : pour rendre homogène, éliminer le taux d’humidité. - Lecture : calcul le nombre de bactéries. 2- Criblage et purification des entérobactéries : A partir de boîtes d’EMB, repérer 3 colonies par la réalisation d’un frottis. Ensemencer les 3 colonies par stries fines et très serrées. Incuber 24h à 37°C. - Lecture : noter la morphologie des colonies. Gélose nutritive (GN) « milieu de base » Gélose Eosine Methylen Bleu (EMB) Extrait de viande 1 g/L Peptone (source de carbone & azote) 10 g/L Extrait de levure 2.5 g/L Lactose (source d’énergie) 10 g/L Peptone 5 g/L Eosine (colorant, inhibiteur) 0.4 g/L Chlorure de sodium 5 g/L Bleu de méthylène (colorant, inhibiteur) 0.0625 g/L Agar 15 g/L Hydrogénophosphate de potassium (sels minéraux) 2 g/L pH 7 Agar 15 g/L pH 6.8 Colonies violet foncé : bactéries fermentent le lactose, acidification du milieu (lactose +). Colonies gris : bactéries ne fermentent pas le lactose (lactose -), alcalinisation de milieu, elles vont utiliser le carbone de peptone, pas de β-galactosidase (n’utilise pas le lactose). Flamme bleue stérilisante Dessiccateur : il contient en bas un gel absorbe l’humidité, s’il est sec la couleur est changée (bleu), humide (rose). Nacelle : pour peser GN : relativement simplifiée, sa formulation apporte les éléments nutritifs nécessaires à la croissance d’une grande variété de germes non exigeantes. Elle est utilisée pour la culture et numération des microorganismes ne présentant pas d’exigences particulières. EMB : constitué d’éosine et de bleu de méthylène, qui sont des agents faiblement sélectifs. Ils n’inhibent que partiellement le développement des microorganismes gram+. De plus ces colorants assurent la différenciation entre les germes lactose+ et les germes lactose-. TP 2 : Identification Biochimique D’une Souche Bactérienne (Galerie Biochimique Classique) Galerie : Ensemble de tests. Composé d’une série de tubes contenant chacun milieu spécifique. L’utilisation de chaque milieu est destinée à établir l’existence ou non d’un métabolisme. Les milieux : Liquide : bouillon nitraté, Clark et Lubs, urée Indole, gélose nutritif. Solide : gélatinase, TSI, Citrate de Simmons, mannitol mobilité. Pour ensemencer un milieu liquide : - Pipette pasteur à bout effilé (prendre un volume) (pas boutonné). - Anse de platine avec boucle (prendre une goutte). Pour ensemencer un milieu gélose : - Incliné avec culot : anse de platine à fil droit, pipette pasteur à bout boutonné, piqûre centrale. - Incliné sans culot (que la pente) : anse de platine à fil droit, pipette pasteur à bout boutonné ou serré. - Non incliné (que le culot): anse de platine à fil droit, pipette pasteur à bout boutonné ou serré. Piqûre centrale. Métabolisme énergétique : - Recherche de catalase : Bulles : présence du catalase, dégradation de peroxyde d’oxygène en eau + oxygène. - Recherche de l’oxydase : en disque couleur violette : présence de cytochrome oxydase. - Recherche de Nitrate réductase (bouillon nitraté): si négatif on ajoute la poudre du Zinc couleur rose ou rouge : la bactérie réduit les nitrates en nitrite, NIT1,NIT2. Si incolore, la bactérie réduit les nitrites jusqu’au stade azote gazeux Métabolisme glucidique : Métabolisme protéique : Gélatine : substance complexe azotée, isomère de l’osséine, extraite des os, des cartilages. La gélatine nutritive est un milieu de culture utilisé pour la recherche de la gélatinase Gélatinase : reste liquide, gélatine hydrolysée par gélatinase : + Uréase : rouge : + jaune : - Trp : donne Indole Indole+kovacs : rouge + jaune - TDA : brune : + Jaune : - : pas de production de TDA Lecture directe : bouillon nitrate, Clark et Lubs et l’urée Indole. Lecture indirecte : Citrate de Simmons : Un virage de la couleur + croissance : utilise citrate comme source de carbone TSI : Culot : glucose / Pente : lactose + saccharose : pente jaune : lac/sac + / pente rouge : lac et sac - / culot jaune : glucoose + AAF/ culot rouge : glucose – AS/ précipité noir : production H2S/ Production de gaz : décollement Mannitol mobilité : couleur changée : acidification, utilisation de mobilité, pas de mobilité (croissance au piqûre uniquement) Urée Indole : Kovacs VP : rose (+) : présence d’acétoine RM : jaune (-) : milieu neutre, la bactérie acidifie peu. rouge (+) : milieu acide, la bactérie provoque une forte acidification du milieu. Attaque fermentative : impliques les réactions d’oxydo-réduction où l’oxygène moléculaire n’intervient pas. Ces réactions donnent naissance à des produits intermédiaires ou finaux tel que : alcool, aldéhyde. Attaque oxydative : phénomène respiratoire où l’oxygène moléculaire intervient comme agent d’oxydation indispensable. Quand la réaction est complète l’oxydation aboutit à la formation de CO2 et H2O sans dégagement de gaz. Quand la réaction est incomplète, on obtient des produits intermédiaires acides en quantité toujours faible. TP3 : Technique d’étude de la croissance Cellule : c’est une lame particulière. Elle a des quadrillages. Un peu creuse. Un plateau pour le dépôt. Une rigole pour l’excès de milieu. Cellules : Burcker, Nageur, Thoma, Malasaise, Neubauer On compte en diagonal uploads/Geographie/ interro-micro.pdf