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TD CORRECTION REVISION MICROBIO BIO2 TD CORRECTION REVISION MICROBIO BIO2 PARTI

TD CORRECTION REVISION MICROBIO BIO2 TD CORRECTION REVISION MICROBIO BIO2 PARTIE GENETIQUE BACTERIENNE PARTIE GENETIQUE BACTERIENNE 1. 1. PRODUCION ET TITRAGE D’UN STOCK DE PHAGES PRODUCION ET TITRAGE D’UN STOCK DE PHAGES 1.1. Production d’un stock de phages 1.1.1. Préparation de la souche bactérienne Quel est le rôle du CaCl2 ? rendre les cellules compétentes et faciliter l’adsorption phagique en perméabilisant la membrane des bactéries pour faciliter l’entrée (pénétration) de l’ADN phagique. Que se passe-t-il durant l’incubation sous agitation ? les membranes des cellules bactériennes se fragilisent et l’agitation mécanique amplifie le phénomène. 1.1.2. Infection phagique Que se passe-t-il durant ces 15 minutes d’incubation sans agitation ? adsorption phagique sur la bactérie et injection de l’ADN phagique. Pourquoi ne faut-il pas agiter ? Il ne faut pas agiter sinon les phages ne parviennent pas à s’adsorber sur les bactéries en phase de croissance. Pourquoi prélever 10L de suspension phagique ? Expliquer les calculs. 1010 particules phagiques/mL = 108 particules phagiques pour 10 µL. Donc le volume de suspension bactérienne à prélever pour obtenir une multiplicité d’infection 1 phage-1 bactérie est de : 108 x 1000/5.108 = 200 µL pour une absorbance de 1 (1 UA = 5.108 bactéries dans ce cas) Remarque : les volumes de phages est bactéries sont à ajuster selon le titre phagique approximatif et l’absorbance de la suspension bactérienne. 1.1.3. Mise en culture Témoin. Lequel ? Donner sa composition et son intérêt. Composition : Gélose molle + bactéries sans phages. intérêt : montrer que les bactéries son viables sur milieu LB et qu’elles ne sont pas déjà infectées. Lors de la lecture, il doit y avoir un tapis bactérien et une absence totale de plages de lyse. Que va-t-il se passer durant la nuit d’incubation ? Les bactériophages provoquent un cycle lytique, ils se multiplient et lysent les cellules infectées, de nouveaux virions sont libérés et vont à leur tour infecter les cellules voisines en croissance, on obtient ainsi des phages de lyses. 1.1.4. Extraction des produits phagiques Donner le mode d’action du chloroforme. Il s’agit d’un solvant organique qui désorganise les membranes composées de phospholipides en entraînant l’éclatement des cellules. L’objectif étant de débarrasser la suspension phagique de toutes les cellules vivantes (bactéries) pour que le titre phagique reste stable. 1.2. Titrage d’un stock de phages 1.2.1. Numération approximative rapide: Technique des spots Trucs et astuces : - lors de l’ajout de la gélose molle bien préparer votre poste de travail et déposer la gélose dans tous les tubes avant de couler rapidement et de bien répartir la gélose molle sur toute la surface de la boîte. - attendre la prise en masse et le séchage complet de la surface (très important pour éviter les coulures) - lors des dépôts vous travaillez sur des tous petits volumes, attention de bien homogénéiser lors de la prise d’essai agiter le tube soigneusement et aspirer/refouler 3 fois en faisant des mouvements de rotation avec le cône de la pipette automatique en remontant vers le haut. Ensuite, déposer le volume pipette droite bien calée en positionnant l’embout du cône très proche de la gélose pour éviter les projections de phages (plages de lyse parasites en JII). ATTENTION : toujours visualiser et réfléchir le geste technique avant de le réaliser, tout en vérifiant que votre poste de travail est bien organisé (pas de croisement de bras et de passage des mains sur la gélose) et qu’il ne vous manque rien. 1.2.2. Numération précise Idem dénombrement classique. Trucs et astuces : BTS Bio 2 – 2007-2008 1 - Bien choisir la valeur cible et l’encadrer. Attention de bien regarder le volume à déposer…ça change tout. ANNALES 2004 : « objectif : être capable de déchiffrer à travers un sujet les attentes, les exigences du jury concernant les gestes techniques et le raisonnement » Quelles sont les questions à se poser ??? JOUR 1 BTS Bio 2 – 2007-2008 2 JOUR 2 BTS Bio 2 – 2007-2008 3 2. 2. TRANSDUCTION GENERALISEE TRANSDUCTION GENERALISEE 2.1. Préparation souche réceptrice Culture d’une souche sauvage de E.coli MC 4100 Quel doit être son phénotype ? tétracycline sensible Pourquoi ? pour pouvoir sélectionner les cellules qui ont reçu le transposon Tn10 qui confère le gène de résistance à la tétracycline et éliminer les cellules qui n’ont pas acquis le gène de résistance. 2.1.1. Transduction La multiplicité d’infection pour une transduction correcte est : 1 phage – 1 bactérie. Le stock titre à …….. particules/ml. Réaliser 1 témoin : lequel et dans quel but ? 200µL de cellules compétentes, pas de phages, le volume de phage est remplacé par du milieu LB, permet de vérifier que la souche E.coli MC4100 est bien sensible à la tétracycline. Le jour de la lecture, il ne doit pas y avoir de pousse sur le milieu LB + tétracycline pour permettre la validation des résultats. - Laisser au repos pendant 15 minutes à température ambiante sans agitation.Que ce passe-t-il durant l’incubation ? il va y avoir adsorption des phages sur les récepteurs spécifiques présents à la surface des bactéries sensibles rendues compétentes par les ions Ca2+. Puis, injection de l’ADN phagique dans les bactéries compétentes et puis réplication. 2.1.2. Expression phénotypique - Quel est le rôle du citrate ? le citrate de sodium neutralise l’action des ions calcium en les complexant (citrate de sodium = chélateur des ions calcium) et imperméabilise la membrane bactérienne. Ainsi, les nouveaux virions libérés lors des cycles lytiques induit par les phages ne pourront plus infecter de nouvelles cellules bactériennes. Objectif : éviter la surinfection et la lyse de l’ensemble des cellules si on laisse les phages se propager. - Incuber 40 minutes à 37°C sous agitation en aérant la suspension toutes les 10 minutes en respectant les conditions d’asepsie. Que va-t-il se passer durant l’incubation ? les phages qui ne sont pas transduits (contenant uniquement de l’ADN viral) vont se répliquer dans les bactéries et produire de nouveaux virions qui vont être libérés par lyse des bactéries (cycle lytique). Les phages transduits (contenant de l’ADN bactérien) vont intégrer le transposon dans le génome bactérien par le mécanisme de recombinaison homologue. 2.1.3. Récolte et isolement des transductants isolement sur milieu sélectif : milieu LB + tétracycline (10g/ml) + citrate de sodium à la surface de la gélose. Que se passe-t-il durant la nuit ? 2 possibilités : - une partie des cellules bactériennes intègrent le transposons Tn10 par recombinaison homologue et deviennent résistantes à la tétracycline et vont pouvoir se développer sur la gélose LB + tétracycline, il y a donc sélection des cellules transduites : pousse + - Par contre, les cellules qui n’ont pas intégrées le Tn10 (non transduites) ne vont pas pouvoir se développer sur le milieu LB + tétracycline : pousse - Qu’est-ce qu’un transductant ? bactérie réceptrice qui a intégré par recombinaison homologue un fragment d’ADN bactérien d’une cellule donatrice injecté par un phage transducteur (voir cours). 2.1.4. Compte rendu BTS Bio 2 – 2007-2008 4 - Justifiez l’utilisation du milieu sélectif : LB + tétracycline. Permet la sélection des transductants : bactéries qui ont intégrées le Tn10 - Dans une population stock de P1, il y a 0,1% de particules qui sont des particules transductrices. Un phage P1 « emporte » 2% du chromosome bactérien, il y a donc 2% de particules transductrices qui portent un gène donné parmis tous les gènes du chromosome bactérien. Calculer le nombre théorique de transductants : si A = 0.950 C = 0.950 x 5.108 = 4.8.108 cellules/mL. La multiplicité d’infection est d’1 phage pour 1 bactérie donc si le volume de bactérie est de 200 µL, on a 4.8.108 x 200.10-3 /1 = 9.5.107 bactéries donc l’équivalent en phage mis en contact avec la bactérie et étalé. - 0.1% des 9.5.107 sont des particules transductrices : 9.5.107 x (0.1/100) = 9.5.10 4 particules transductrices - 2% des particules transductrices portent le gène donné : 9.5.104x (2/100) = 1900 particules avec le gène donné. - explication différence théorique pratique : soucis d’intégration du Tn10 par recombinaison homologue : transduction abortive et soucis de très faible probabilité de tomber sur les particules transductrices lors de la mise en contact bactérie - phage. - Calculer le rendement de la transduction : R = nombre réel de transductants /nombre théorique de transductants x 100 = 2/1900x100 = 0.1%. - Donner le mode d’action de la tétracycline : action sur la synthèse des protéines, elle se fixe sur la fraction 50 S des ribosomes et empêche la pénétration ou la fixation du complexe acide aminé-ARNt. EXERCICE : A partir d’une suspension bactérienne donnant une absorbance de 0.610 et en sachant que 1UA = 5.10 8 bactérie/mL. Déterminer le volume de suspension phagique (titre approximatif de 2.109 UFP/mL) à ajouter pour obtenir une multiplicité d’infection proche de 1 phage pour 4 bactéries et ceci dans un volume final de 7 mL de suspension bactérienne. 3. 3. LYSOGENIE LYSOGENIE - Justifier l’ajout de MgS04 et de maltose au milieu de culture utilisé pour la croissance de la souche sensible E.coli uploads/Geographie/ revision-bio.pdf