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Université Mohamed Khider de Biskra Faculté des sciences exactes et sciences de

Université Mohamed Khider de Biskra Faculté des sciences exactes et sciences de la nature et de la vie Département des sciences de la nature et de la vie Domaine : Sciences de la nature et de la vie Filière : Sciences biologiques Spécialité : Microbiologie appliquée Réf. : ……………………………………………… Présenté et soutenu par : Sondous KIRAM Le : mardi 9 juillet 2019 Thème Caractérisation des bactéries associes aux nodules de la légumineuse Astragalus de la région de Biskra Jury : Mme. DJOOUAMA Manel MAA Université de Biskra Président Mme. MOKRANI Djamila MAA Université de Biskra Rapporteur Mme. BABA ARBI Souad MCB Université de Biskra Examinateur Année universitaire : 2018 - 2019 MÉMOIRE DE MASTER Remerciement Nous tenons tout d’abord à remercier Dieu le tout puissant et miséricordieux, qui nous a donné la force et la patience d’accomplir ce modeste travail. J’adresse mes remerciements les plus sincères à mon encadreur Mᵐᵉ MOKRANI Djamila pour le grand honneur qu’elle m’a fait en acceptant de diriger travail, pour ses recommandations et ses conseils qui ont beaucoup enrichi mon travail. Nous voudrons également exprimer nos gratitudes à tous les ingénieurs de laboratoire et aussi l’équipe de la bibliothèque Enfin, je remercie toutes les personnes qui ont participé de loin ou de près à la réalisation de ce travail. Mes amis de la faculté en général et de la 2ème année Master Microbiologie Fondamentale et Appliqué 2019 en particulier pour leur soutien moral et leur inspiration Dédicace Je dédie ce modeste travail à mes très chers parents, prunelles de mes yeux, J’espère leur inspirer joie et fierté. Mes sœurs Mes frères Ma famille A toutes les personnes qui m’ont aidé pour l’élaboration de ce travail Sondous Sommaire Remerciement Dédicace Liste des tableaux Liste des figures Liste des abréviations Introduction Partie 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE chapitre 1 : GENERALITE 1.1Le cycle d’azote ................................................................................................................. 3 1.2.Fixation biologique de l’Azote (FBA) .............................................................................. 4 Chapitre 2 : LA SYMBIOSE LEGUMINEUSE-RHIZOBIA 2.1Mécanisme de la symbiose ................................................................................................ 6 2.2.Mécanisme de la nodulation ............................................................................................. 6 2.2.1.Partie bactérienne : BNL ............................................................................................ 7 2.2.2.Partie végétale : La famille de Fabaceae .................................................................... 7 2.3.Le genre Astragalus ........................................................................................................ 10 Astragalus gombo ............................................................................................................. 10 Astragalus maréoticus ...................................................................................................... 10 Astragalus armatus ........................................................................................................... 10 Astragalus cruciatus ......................................................................................................... 10 2.4.Utilisations thérapeutiques : ........................................................................................... 11 Partie 2 : PARTIE EXPERIMENTALE Chapitre 3 : MATERIEL ET METHODES 3 .1.Isolement des bactéries à partir des nodules .................................................................. 12 3.1.1. Source des isolats .................................................................................................... 12 3.1.2. Stérilisation des nodules et Isolement des souches à partir des nodules ................. 13 3.2. Caractères morphologiques et culturaux ....................................................................... 13 3.2.1. Préparation de milieu de culture ............................................................................. 13 3.2.2. Purification des isolats ............................................................................................ 14 3.2.3. Conservation des souches ....................................................................................... 14 3.3. Examen microscopique .................................................................................................. 15 3.3.1. Coloration de Gram ................................................................................................. 15 3.4. Caractérisation phénotypique des isolats ....................................................................... 15 3.4.1. La résistance intrinsèque aux antibiotiques ............................................................ 15 3.4.2. La sensibilité aux métaux lourds ............................................................................. 16 3.4.3. Caractérisation des isolats : la galerie API20 E ...................................................... 16 3.5. Effet de la température .................................................................................................. 18 3.6. Effet de l’herbicide ........................................................................................................ 18 3.6.1. En milieu solide ...................................................................................................... 19 3.6.2. En milieu liquide ..................................................................................................... 19 Chapitre 4 : RESULTATS ET DISCUSSION 4.1. Caractérisation morphologique et culturaux .................................................................. 20 4.1.1. Isolement et identifications ..................................................................................... 20 4.1.2. Croissance des isolats sur milieu YMA .................................................................. 20 4.1.3. Coloration de Gram ................................................................................................. 21 4.1.4. La sensibilité des antibiotiques ............................................................................... 21 4.1.5. La sensibilité des métaux lourds ............................................................................. 22 4.1.6. Galerie API20E : ..................................................................................................... 23 4.1.7. Effet de la température ............................................................................................ 27 4.1.8. Effet de l’herbicide ................................................................................................. 30 Conclusion ............................................................................................................................... 39 Bibliographie ........................................................................................................................... 41 Annexes Résumé I Liste des tableaux Tableau 1 : Quelques espèces des légumineuses ...................................................................... 9 Tableau 2: Solution d'antibiotiques utilisés ............................................................................ 16 Tableau 3: Concentrations et les solvants des métaux utilisés ............................................... 16 Tableau 4 : Intervalle des concentrations minimales inhibitrices des métaux lourdes .......... 22 Tableau 5: Identification des isolats en utilisant système l'API 20 E ..................................... 23 Tableau 6 : Effet de Roundup sur la croissance des isolats .................................................... 31 II Liste des figures Figure 1: Cycle d'azote (site web1) ........................................................................................................ 4 Figure 2 : Les étapes de la nodulation (site web 2) ................................................................................ 7 Figure 3 : Localisation géographique des zones de prélèvement dans la région de Biskra (Site ......... 13 Figure 4 : Ensemencement par la technique des quatre cadrans (Vincent, 1970) ................................ 14 Figure 5 : Inoculation de pré culture dans les puis de galerie API 20E (photo original) ..................... 18 Figure 6 : Morphologie et la croissance les colonies des isolats sur YMA (photo............................... 20 Figure 7 : Effet de différents antibiotiques sur la croissance des souches ........................................... 22 Figure 8 : Identification des isolats en utilisant système l'API 20E (photo original) ........................... 27 Figure 9 : Effet de la température de 37°C sur les isolats ................................................................... 28 Figure 10 : Effet de la température 40°C sur les isolats ........................................................................ 29 Figure 11: Effet de la température 45°C sur les isolats ........................................................................ 30 Figure 12 :Effet de Roundup à 25 mg /ml (photo originale) ................................................................ 32 Figure 13 : Effet de Roundup à 50 mg /ml ........................................................................................... 33 Figure 14 : Effet de Roundup à 100 mg /ml (photo originale) ............................................................. 33 Figure 15 : Courbe de croissance de la souche MB10 ......................................................................... 35 Figure 16 : Courbe de croissance de la souche F16 ............................................................................. 35 Figure 17 : Courbe de croissance de la souche GB15 .......................................................................... 36 Figure 18 : Courbe de croissance de la souche GR12 .......................................................................... 36 Figure 19 : Courbe de croissance de la souche K24 ............................................................................. 37 Figure 20 : Courbe de croissance de la souche C45 ............................................................................. 37 Figure 21 : Courbe de croissance de la souche MH6 ........................................................................... 38 Figure 22 : Courbe de croissance de la souche CK4 ............................................................................ 38 III Liste des abréviations A : Astragualus. BNL : bactéries nodulant les Légumineuses. CaCl2 : Chlorure de Calcium. CaCo3 : Carbonate de Calcium. CIT : Citrate GEL : Gélatinase GLU : Glucose H : Heure H2S : Sulfure d'hydrogène HgCl2 : Chlorure de mercure. IND : Indole INO : Inositol LDC : Lysine décarboxylase MAN : Mannitol MEL : Melibiose MNA : Mannitol Nitrate Agar MNB : Mannitol Nitrate Broth N2 : Azote atmosphérique. ODC : Ornithine décarboxylase ONPG :Ortho-Nitro-Phényl-Galactoside RHA : Rhamnose SAC : Saccharose SOR : Sorbitol TDA : Tryptophane désaminas URE : Uréase VP : Pyruvate de sodium YMA: Yeast Mannitol Agar. YMB: Yeast Mannitol Broth . ZnCl2 : Chlorure de Zinc Introduction Introduction 1 Introduction Le sol constitue un support pour différents cycles d’échanges d’énergie et de transfert de substances entre les différentes entités qui l’abritent. Un des cycles les plus importants est le cycle de l’azote. La fixation biologique de l’azote (N2) s’est généralement concentrée sur le système symbiotique entre les légumineuses et les rhizobia, parce que ces associations ont le plus grand impact quantitatif sur ce cycle. Il existe approximativement 700 genres et 13000 espèces de légumineuses, mais seule une portion de 20% qui constitue les légumineuses d’importance agricole a été étudiée (EL-Hilali, 2006). Les symbioses végétales sont une composante fondamentale de la stabilité et de la durabilité des écosystèmes. L’introduction des légumineuses, associées à leurs auxiliaires microbiens ﬁxateurs d’azote améliore la biodisponibilité d’éléments nutritifs, dans des sites dégradés fortement appauvris en éléments nutritifs, Elle consiste une condition primordiale pour réussir l’installation de plantes en milieu particulièrement contraignant, comme le sont les sites de carrière de calcaire après exploitation sous climat méditerranéen. (Brunel et al., 2007) Les légumineuses figurent parmi les dons de la nature les plus abondants et les plus précieux. Elles fournissent un nombre important de produits et améliorent la fertilité des sols. Ces produits sont les principales sources, de protéines pour la plupart des pauvres à travers le monde, à l’huile végétale, au fourrage et bois combustible. Elles améliorent aussi la fertilité des sols grâce à leur capacité de fixer l’azote ( Dekak , 2010). Le genre Astragalus de la famille des Fabacées comprend plus de 1500 espèces dont la plupart se répartissent en Orient. Une cinquantaine d’espèces sont retrouvées en Afrique du Nord et quinze environ au Sahara (Teyeb et al., 2012). Les rhizobia , deuxième élément de l’association, sont des bactéries du sol capables d'induire sur les racines des légumineuses la formation d'organes particuliers, les nodosités, au sein desquels ils réduisent l'azote de l'air. Dans cette association à bénéfice mutuel, la plante fournit une niche protectrice et de l'énergie aux bactéries qui, en échange, synthétisent de l'ammoniac pour leur hôte. Cette symbiose rhizobia-Légumineuse (actuellement dénommée Symbiose Légumineuse- bactéries nodulant les légumineuses (BNL) fournit chaque année, à l'échelle de la planète, une quantité d'azote équivalente à celle synthétisée par voie chimique dans l'industrie des engrais, et joue donc un rôle écologique et économique considérable (Sebihi , 2008 ). Introduction 2 Dans le cadre de la recherche de couples symbiotiques légumineuse-rhizobia efficients, pour la réhabilitation des écosystèmes appauvris et dégradés, l’identification et la caractérisation de la bactérie symbiotique (rhizobia) constitue un préalable à toute application. D’un point de vue taxonomique, les rhizobia sont diversifiés avec près de 6 genres décrites à uploads/Geographie/ sondous-kiram.pdf