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اﻟﻤﺪرﺳﺔ اﻟﻮطﻨﯿﺔ اﻟﻌﻠﯿﺎ ﻓﻲ اﻟﺒﯿﻮﺗﻜﻨﻮﻟﻮﺟﯿﺎ ﺗﻮﻓﯿﻖ ﺧﺰﻧﺪار Ecole Nationale Supérieur

اﻟﻤﺪرﺳﺔ اﻟﻮطﻨﯿﺔ اﻟﻌﻠﯿﺎ ﻓﻲ اﻟﺒﯿﻮﺗﻜﻨﻮﻟﻮﺟﯿﺎ ﺗﻮﻓﯿﻖ ﺧﺰﻧﺪار Ecole Nationale Supérieure de Biotechnologie TaoufikKhaznadar République Algérienne Démocratique et Populaire وزارة اﻟﺘﻌﻠﯿــــﻢ اﻟﻌــــﺎﻟﻲ واﻟﺒﺤـــــﺚ اﻟﻌﻠــــﻤﻲ Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique __________________________________________________ 1/3 Génétique moléculaire et plasticité des génomes microbiens TD N°2 : mécanismes moléculaires des transferts horizontaux Exercice 1 Une culture d'E. coli est infectée simultanément avec deux souches de phage λ. Une souche est mutante pour la spécificité d'hôte, sensible à la température, et produit des plages clairs (génotype h st c), alors que l'autre souche porte les allèles de type sauvage correspondants (génotype h + st+ c + ). Les phages produits par l'infection sont collectés à partir de cellules lysées et sont étalées sur des bactéries indicatrices. Les génotypes des phages issus de l'infection mixte, déduits de la morphologie des plages sont les suivants : a) Rappeler quel(s) type(s) de cycle de vie peut présenter le phage λ. b) D'après vos connaissances, expliquez ce qu'est la spécificité d'hôte. c) Déterminer l'ordre et les distances cartographiques entre les trois gènes. Génotypes des phages Nombre de plages h+ c+ st+ 321 h c st 338 h+ c st 26 h c+ st+ 30 h+ c st+ 106 h c+ st 110 h+ c+ st 5 h c st+ 6 2/3 Exercice 2 On dispose, chez E.coli, des souches A, B, C et D de génotype respectif : A : (cysB–; tyr1–; tyr2+; strR); B : (cysB–; tyr1+; tyr2–; strR); C : (cysB+; tyr1–; tyr2+; strR); D : (cysB+; tyr1+; tyr2–; strR). où cysB, tyr1 et tyr2 sont des mutations ponctuelles respectivement responsables d’une auxotrophie pour la cystéine ou pour la tyrosine. strR étant une mutation de résistance à la streptomycine. 1. Des expériences de conjugaisons interrompues, avec 15 secondes de précision, entre une Hfr sauvage et des réceptrices tyr1 ou tyr2 donnent un temps de transfert égal pour tyr1+ et tyr2+, à 30 secondes après cysB+, plusieurs dizaines de minutes avant le site str. a) Quelles ont été les réceptrices utilisées ? b) Quels ont été les milieux de cocultures et d’étalement ? c) Qu’en peut-ont conclure pour tyr1 et tyr 2 sur le plan cartographique ? Sur le plan fonctionnel ? Justifier vos réponses de manière claire et concise. 2. Un test trois points l’ordre suivant: cysB-tyr2-tyr1. Reconstituer le protocole de ce test trois points, réalisé par transduction, sachant la disponibilité du phage transducteur P1 et des quatre souches de E. coli, A, B, C et D. a) Quels sont les croisements effectués ? Avec quels lysats à partir de quelles souches donatrices ? Sur quelles souches réceptrices ? Quels sont les recombinants sélectionnés ? Sur quels milieux ? b) Quels sont les résultats possibles sur la base d’un schéma ? Quel est le résultat obtenu ? Quelle est l’argumentation permettant de justifier la conclusion à partir du résultat obtenu ? Exercice 3 Une souche F– de E. coli, mutée sur ces deux gènes purF et pheS et de phénotype [pur– ; phe–], auxotrophe pour les purines et la phénylalanine. À partir de cette souche sont isolés deux mutants [his–], auxotrophes pour l’histidine et notés F1 et F2, les mutations étant respectivement notées his1 et his2. On dispose des trois souches Hfr H, A ou K, chacune délétée pour le gène argE, situé à 88 min sur la carte de E.coli. La Hfr H transfère ses gènes dans le sens des aiguilles d’une montre, les deux autres Hfr dans le sens inverse. 1. On croise chacun des mutants F1 et F2 par la HfrH, A ou K. On étale les conjugants après 50 minutes de croisements, après les avoir séparés par vortex, sur un milieu MM + pur + phe. On obtient des colonies dans tous les cas. a. Quelle est votre conclusion ? Justifier vos réponses. 3/3 b. Justifier le phénotype des Hfr 2. On recommence les croisements entre la Hfr K et les souches F1 et F2. On étale les conjugants après 30 minutes de croisement, après les avoir séparé par vortex, sur un milieu MM + his + pur. Les colonies obtenues sur ces boîtes mères sont testées par réplique sur des boîtes MM + pur, 60 % y poussent, et sur des boîtes MM + his, 40 % y poussent. On n’obtient pas de recombinants [phe+] dans le croisement entre la Hfr A et les souches réceptrices F1 ou F2, après 50 minutes de croisement, mais on obtient des recombinants [pur+] ou [his+]. - Qu’elle conclusion en tirer vous ? Justifier votre réponse. 3. La conjugaison interrompue montre que les séquences his1+ et his2+ sont localisées au même endroit de la carte, i minutes après l’origine de transfert de K. On sélectionne, parmi les colonies testées à la question précédente, des colonies F′1 et des colonies F′2 de phénotype [pur+, his–, phe–] afin de les croiser avec des Hfr dérivées de K, porteuses de la même mutation d’auxotrophie aux purines que la souche F, et porteuses soit de la mutation his1, soit de la mutation his2. Ces Hfr sont respectivement notées K1 et K2. • Le croisement K1 avec F′2 [pur+, his–, phe–] est réalisé, on observe 225 colonies sur milieu Mo. • Le croisement K2 avec F′1 [pur+, his–, phe–] est réalisé et on observe 75 colonies pour un sur milieu Mo. - Que conclure ? Justifier vos réponses en les accompagnant de schémas clairs et précis et en justifiant les génotypes des souches utilisées dans les croisements. 0/100 Arg E 88min Hfr A 80min Hfr K 50min Hfr H 95min uploads/Geographie/ td-2 1 .pdf