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1 1. Introduction : L’eau est l’élément le plus demandé et le plus essentiel da

1 1. Introduction : L’eau est l’élément le plus demandé et le plus essentiel dans la vie. On l’utilise quotidiennement pour différentes applications, par exemple l’alimentation et le lavage des aliments ou de matériels… Et pour ces buts ou d’autres l’eau doit représente des qualités microbiologique et physico-chimiques satisfaisantes. Dans cette TP nous sommes plus intéressants par le recherche dans l’échelle microbiologique, l’orientation de TP été vers : la réalisation des analyses sur l’eau, le rechercher des différents types des germes, la comparaison entre les germes présent dans deux types d’eau (eau potable (de robinet) et l’eau pollué) en plus l’identification des germes. Notre groupe a été choisi pour les recherches dans l’eau pollué. Les germes visés pour la recherche sont : -les germes aérobies mésophiles et psychrophiles dans le milieu PCA gélosé : cette recherche indique plusieurs critères ; l’origine de cette eau, les traitements qu’il a subi. C’est à dire une évaluation de cette eau, un indicateur de la qualité générale et de la stabilité. La recherche des germes à 20°C indique la recherche des germes pathogènes ou résistants. -les coliformes totaux à 30°c dans le milieu BCPL : permet de signalé une contamination fécale d’origine animale, c'est-à-dire une évaluation de risque de présence des germes pathogènes. -les streptococcus type D dans le milieu Rothe : c’est une recherche d’un germe pathogène. Pour l’évaluation des risques sanitaires de cette eau. 2. Matériel et méthodes : a.matériel : Les verreries : Tube à essais, boite de pétri, des portoirs à tubes, flacons, pipettes pasteur, pipettes à 5ml et à 1ml, des lames, des lamelles, cloche de Durham. (Tout le matériel doit être stérile). Les appareils : Microscopes, Compteur colonie, incubateur, bec bunsen. Les milieux de cultures utilisés :  Représenté dans l’annexe I Les indicateurs chimiques : Rouge de méthyle, réactif de Vogs-Proskauer, le réactif de Kovacs. 2 d. méthodes d’analyse : 1. le premier jour : Pour la recherche des FAMT/FAPT : On a réalisé des dilutions à partir de la solution mère. Trois tubes contiennent 9 ml d’eau physiologique stérile préparées par l’enseignant, avec une pipette stérile de 1 ml on ajout 1 ml à partir de flacon qui contient la solution mère et met dans le premier tube «c’est le tube de dilution (10-1) », après une homogénéisation été réalisée. Avec la mémé pipette on a prend 1 ml à partir de tube de dilution (10-1) et met dans le deuxième tube « c’est le tube de dilution (10-2) ». Avec la mémé pipette on a prend 1 ml à partir de tube de dilution (10-2) et met dans le troisième tube « c’est le tube de dilution (10-3) ». Après On a met 1 ml de solution de dernier tube de dilution (10-3) dans chaque boites pétri. Après on a collé les boites par 10 à 15 ml de milieu PCA préparé et liquidifié par l’enseignant et on a effectué des mouvements en forme de ∞ pour bien mélanger l’inoculum, après la solidification de milieu on a incubé les boites à 30°C et 20°C pendant 72 heures. (Selon le schéma 1). Eau à analysé 10-1 10-2 10-3 PCA 37°C EP2 10-2 PCA 20°C 10-3 EP2 Incubation à 37°C et à 20°C. 1 ml 1 ml 3 Pour la recherche des coliformes totaux : La méthode utilisée c’est « 333 », dans la quelle, on a utilisé neuf tubes remplies (9 ml) par le milieu BCPL et chaque tube contient une cloche de Durham préparé par l’enseignant, par différents concentrations, trois tubes doubles concentrés (D/C) et six simple concentrés (S/C). Pour les trois tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée, On a ajouté 1 ml de la même solution dans trois tubes simples concentrés et 0.1 ml (=trois gouttes par pipettes pasteur) de la solution mère dans les trois tubes simples concentrés qui restes. Il faut bien mélanger les tubes et chasser le gaz dans les cloches. Après on a l’incubation à 37°C pendant 24 à 48 h. (Selon le schéma 2). Double concentré simple concentré simple concentré L’incubation à 37°C pendant 24 à 48 h. Pour la recherche des streptococcus type D : La méthode utilisée c’est « 511 », dans la quelle, on a utilisé septe tubes remplies (9 ml) par le milieu Rothe préparé par l’enseignant, par différents concentrations, cinq tubes doubles concentrés (D/C) et deux tubes sont simple concentrés (S/C). Eau à analysé 10 ml 1 ml 0.1 ml 4 Pour cinq tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée, On a ajouté 1 ml de la même solution dans un tube simple concentré et 0.1 ml (=trois gouttes par pipettes pasteur) de la solution mère dans un tube simple concentré qui reste. Après on a l’incubation à 30°C pendant 24 à 48 h. (Selon le schéma 3). Double concentré simple concentré Incubation à 30°C pendant 24 à 48 h 2. le deuxième jour :  On a fait la lecture des résultats et le dénombrement sur touts les milieux à l’aide des tableaux de l’indice NPP.  On a essai d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope photonique.  A partir de milieu BCPL (seulement les tubes positifs et de préférence les tubes doubles concentrés positifs) on a fait un repiquage sur le milieu BCPL gélosé pour but de séparer les colonies produites pour être facile à identifie, ce repiquage faite par culture en surface, on a met la pipette pasteur dans le milieu BCPL et faire des stries sur la gélose collé déjà sur les boites et refroidie, l’inoculum été ensemencé à 30°C pendant 24. (Selon le schéma 4). Eau à analysé 10 ml 1 ml 0.1 ml 5 3. le troisième jour :  On a essai une autre fois d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope photonique.  A partir de milieu BCPL gélosé on a prend une colonie par la pipette pasteur et met dans trois différents tubes par différent mode d’ensemencement, le premier tube est collé par le milieu citrate de Simmons (solidifié en position inclinée) l’ ensemencement fait par des stries sur la surface de la pente par pipettes pasteur, le deuxième est collé par le milieu Kigler-Hajana (solidifié en position semi-inclinée) l’ ensemencement fait par piqure centre (dans le culot) après des stries sur la surface de la pente par pipettes pasteur, le troisième tube est remplis par le milieu Clark et Lubs (milieu liquide) l’ ensemencement fait par l’entrée de la pipettes pasteur dans le milieu, les trois tubes sont pour but d’identification biochimique de la colonie sélectionnée, les trois tubes sont ensuite incubées à 30°C pendant 24h. (Selon le schéma 5). BCPL 37°C EP2 Incubation à 37°C pendant 24h. Tube + 6 4. le quatrième jour :  On fait la lecture des résultats sur le milieu PCA (lecture après 72h).  La lecture directe de résultat sur le milieu Citrate de Simmon et de milieu Kigler-Hajana.  On a divisé la culture de milieu Clark et Lubs dans deux tubes, dans le premier tube on a ajouté des gouttes de solution rouge de méthyle, dans le deuxième tube on a ajouté des goutte de α- naphtol(VP1) et des gouttes de solution de soude à 16% (VP2). le principe de ces réactifs dans l’annexe II. 4. Résultat et discutions : Pour la recherche des FAMT/FAPT : On a fait la lecture sur les boites qui contiennent le milieu PCA après 72h seulement la boite incubée à 30°C contient des colonies, trop chargé, pour facilite la lecture on a divisé la boite en quatre, on a estimée le nombre des colonies présentent d’un quart, il est de 145 colonies à peut prés. Alors le nombre des bactéries dans 1ml de solution égale : Milieu Citrate de Simmons Milieu Kigler- Hajana Milieu Clark et Lubs Incubation à 37°C pendant 24h. L’eau peptonée 7 N = (150 ×4) ×102 = 60000 UFC/ml. Donc le nombre des bactéries aérobies mésophiles totale présentent dans cette eau égale 60000 bactéries par un millilitre. (Schéma 6). Pour le dénombrement des coliformes totaux : Le dénombrement se fait à partir des tubes s tubes dits positives sont :  Les tubes à virage de couleur (couleur jaune).  présentent un dégagement de gaz (les cloches rempliées par le gaz). Par la méthode NPP on a estimée le nombre des coliformes totaux présentent dans l’eau, la méthode de calcule est la suivante : EP2 10-2 PCA 37°C 150 colonies 3×10 D/C 3×0.1 S/C 3×1 S/C + + + + + + + + + 3 3 3 8 Le nombre 333 correspond à > 1100 dans le tableau NPP. Donc le nombre des bactéries calculés égale : (1100 × 10) = >11000 bactéries dans 100ml. L’identification biochimique des coliformes: Les souches pressentant dans le La boite appartient à la famille d’entérobactérie les tests suivants utilisés pour l’identification des genres de cette famille, notre colonie uploads/Geographie/ analyse-microbiologique-d-x27-eau.pdf