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Université Paris 12 IUP SIAL Mlle ROUX 17/11/03 NOVELLO Célia TAP Julien T TP P

Université Paris 12 IUP SIAL Mlle ROUX 17/11/03 NOVELLO Célia TAP Julien T TP P d de e m mi ic cr ro ob bi io ol lo og gi ie e : : A AN NA AL LY YS SE ES S D DE E P PR RO OD DU UI IT TS S L LA AI IT TI IE ER RS S Sommaire I. INTRODUCTION............................................................................................................ 3 II. ANALYSE D’UN LAIT UHT ..................................................................................... 3 A. INCUBATION.................................................................................................................... 3 B. TEST DE STABILITE A L’EBULLITION................................................................................ 3 C. MESURE DU PH................................................................................................................ 3 D. DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES AEROBIE A 30°C ET A 55°C........................... 4 1. Milieu utilisé : PCA.................................................................................................... 4 2. Ensemencement .......................................................................................................... 4 3. Résultats ..................................................................................................................... 4 E. RECHERCHE D’ANTIBIOTIQUES........................................................................................ 4 1. Méthode par acidification .......................................................................................... 4 2. Méthode par diffusion sur gélose............................................................................... 5 III. ANALYSE D’UN BEURRE ........................................................................................ 6 A. MODE OPERATOIRE ......................................................................................................... 6 B. MILIEU UTILISE VRBL (VIOLET CRISTAL /ROUGE NEUTRE/SELS BILIAIRES/GELOSE LACTOSE) :.............................................................................................................................. 6 C. RESULTATS ET DISCUSSION ............................................................................................. 6 IV. ANALYSE D’UN YAOURT ....................................................................................... 6 A. MODE OPERATOIRE : DILUTION EN CASCADE .................................................................. 6 B. DENOMBREMENT STREPTOCOCCUS SALIVARIUS SUBSPO THERMOPHILUS ....................... 7 1. Milieu utilisé :M17..................................................................................................... 7 2. Résultat....................................................................................................................... 7 C. DENOMBREMENT LACTOBACILLUS DELBRUECKI SUBSP BULGARICUS............................. 7 1. Milieu utilisé :MRS..................................................................................................... 7 2. Résultats ..................................................................................................................... 8 3. Gram........................................................................................................................... 8 4. Catalase...................................................................................................................... 8 V. RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE STAPHYLOCOQUES A COAGULASE POSITIVE SUR UN MILIEU AU PLASMA FIBRINOGENE DANS DU LAIT EN POUDRE.................................................................................................................. 9 A. RECHERCHE DE STAPHYLOCOQUES A COAGULASE POSITIVE ........................................... 9 1. Milieux utilisés ........................................................................................................... 9 B. DENOMBREMENT DE STAPHYLOCOQUES A COAGULASE POSITIVE ................................. 10 1. Milieu utilisé : gélose au plasma de lapin fibrinogéne ............................................ 10 3 I. Introduction Le mot lait, sans indication de l’espèce, désigne en France le lait de vache ; il est le produit intégral de la traite totale et ininterrompue d’une femelle laitière bien portante, bien nourrie et non surmené. Le lait est un aliment complet, ce qui signifie qu'il sera également un bon milieu pour les microorganismes, c'est ce qui fait qu'il ne se conserve pas. Un des moyens découvert par l'homme pour augmenter sa conservation est de le faire transformer de façon plus ou moins contrôlée par certains microorganismes de façon à éviter toute autre altération. En gros, cette conservation repose sur l'élimination d'une grande partie de l'eau et sur l'acidification. défavorise le développement des microorganismes. II. Analyse d’un lait UHT D'une manière générale, les hautes températures appliquées pendant un temps très court ont un effet plus puissant sur la destruction des microorganismes et des enzymes que sur les modifications des constituants du lait, ce qui justifie l'intérêt des traitements UHT. De plus, en assurant une montée en température et un refroidissement rapides, les procédés UHT évitent les effets cumulatifs des traitements thermiques et réduisent ainsi les modifications physico-chimiques du lait. A. Incubation B. Test de stabilité à l’ébullition Les bactéries lactiques ont une grande importance en laiterie. Leur principale propriété est de produire de l'acide lactique par fermentation du lactose; certaines produisent en outre du gaz carbonique et divers composés, dont certains contribuent à l'arôme des produits laitiers. Dans du lait non réfrigéré, elles tendent à prédominer, donnant à celui-ci une certaine protection vis-à-vis de germes indésirables. Cependant, la production d'acide lactique, en faisant baisser le pH, provoque une déstabilisation progressive de la dispersion micellaire, ce qui rend le lait de moins en moins stable aux traitements thermiques et peut entraîner sa coagulation, même à température ambiante. Donc le test de stabilité à l’ébullition permet de vérifier qu’il n’y a pas eu production d'acide lactique, et donc que tout les microorganismes ont bien été détruits durant le procédé UHT. Observation : Interprétation : C. Mesure du pH 30°=6.63 temoin=6.66 55=6.39 4 D. Dénombrement des microorganismes aérobie à 30°C et à 55°C 1. Milieu utilisé : PCA C’est une gélose standard universelle utilisée pour le dénombrement des microorganismes saprophytes. En effet, le milieu contient des peptones comme sources d’azotes et du glucose comme source de carbones, les extrait de levures apportant tous les facteurs de croissance nécessaire à la croissance des microorganismes. 2. Ensemencement Pour chacun des 3 pack de lait, on ensemence en surface deux boites de pétri. Pour permettre le dénombrement des microorganismes on procède comme suit : ¾ A partir du pack incubé à 30°C, on ensemence 2 boites de pétri que l’on met à incuber pendant 72 heures à 30°C ¾ A partir du pack incubé à 55°C, on ensemence 2 boites de pétri que l’on met à incuber pendant 48 heures à 55°C ¾ A partir du pack témoin, on incube une boite que l’on place pendant 72 heures à 30°C et une boite que l’on place pendant 48 heures à 55°C 3. Résultats Après incubation, on n’observe aucun de développement de microorganismes. Donc le procédé de pasteurisation UHT a bien été effectué. E. Recherche d’antibiotiques Un lait normalement ne doit pas contenir d’antibiotiques. En effet la présence d’antibiotiques, en général la pénicilline, traduit un traitement de la vache qui est ou a été malade. L’antibiotique peut masquer ou cacher la présence de bactéries pathogènes, entraîner chez le consommateur des réactions allergiques à l’antibiotique, modifier les flores saprophytes du lait, ou sélectionner des souches résistantes. D’autre part, un lait contenant des concentrations trop importantes d’antibiotiques est impropre à la fabrication des dérivés du lait dans laquelle une fermentation intervient :yaourt, fromages, beurre, car ils peuvent inhiber le développement des bactéries, lactiques notamment. 1. Méthode par acidification Pour cette méthode on utilise une culture d’épreuve qui contient : ¾ 10mL de culture de réserve, qui contient des bactéries capable de dégrader le lactose en acide lactique. ¾ 5mL d’extrait de levures :source de vitamine ¾ 10mL de solution de pourpre ce bromocrésol, cet indicateur va nous permettre de savoir s’il y a eu acidification du milieu. Si le lait analysé contient des antibiotiques alors les bactéries ne dégraderont pas le lactose, la couleur du milieu sera donc inchangée. Observation : Les tubes qui étaient bleus au départ virent au jaune, il y donc acidification. Ce qui traduit une absence d'antibiotique 5 2. Méthode par diffusion sur gélose a) Principe Une souche sensible aux antibiotiques est ensemencée dans le milieu Mueller-Hinton coulé en boite de pétri. Sur cette gélose , des disques imprégnés d’antibiotique ou du lait à examiner sont déposés. Après incubation, une zone d’inhibition apparaît autour du disque contenant un antibiotique en quantité suffisante pour être actif sur la souche. La méthode est basée sur la diffusion de substances antibiotiques imprégnées sur des disques en papier préalablement séchés qui doivent être déposés à la surface de la gélose. Les disques appliqués sur l’agar absorbent une quantité d’eau suffisante pour dissoudre l’antibiotique qui diffuse ainsi progressivement dans le milieu, suivant les lois physiques de diffusion des molécules à travers un gel. On utilise comme souche le Bacillus stearothermophilus (souche sensible à la pénicilline). Pour permettre de valider les résultats, on effectue un contrôle positif (Le disque contient un antibiotique auquel la souche utilisée est sensible) et un contrôle négatif (rien a été rajouté au disque) b) Milieu utilisé : Mueller-Hinton Ce milieu est reconnu comme étant le milieu de référence le plus satisfaisant grâce à : ¾ Sa faible teneur en thymine-thymidine ( éléments inhibiteurs de l’activité antibiotique du triméthoprime) diminue les phénomènes de repousse autour de ces disques et permet une détermination précise des diamètres d’inhibition . ¾ Sa concentration en Ca2+ et Mg2+, qui assure une meilleur précision pour la détermination de la sensibilité des Pseudomonas aux aminosides, colistine et tétracyclines. c) Résultats On peut déduire de cet antibiogramme que les 3 pack de lait testés ne contiennent pas d’antibactérien actif sur la souche testée Contrôle positif Contrôle négatif Pastille de lait témoin Lait à 30°C Lait à 55°C 6 III. Analyse d’un beurre Le beurre est fabriqué à partir de la crème du lait cru. A. Mode opératoire On pèse de manière stérile, sous une hotte à flux laminaire, 50 grammes de beurre que l’on place dans un sac à stomacher auquel on ajoute 42 mL de phosphate dipotassique à 2%. On fait fondre le beurre dans un bain d’eau à une température inférieur à 45°C pour ne pas stresser ou léser les bactéries. On récupère alors la phase aqueuse qui se trouve au fond du sac à stomacher. On effectue ensuite une dilution 10–1. Pour cela, on prélève 1mL de solution mère que l’on place dans 9mL d’eau peptonée. Afin de dénombrer la flore contaminante on effectue un ensemencement en profondeur de 1mL de solution par boite. B. Milieu utilisé VRBL (Violet cristal /rouge neutre/sels Biliaires/gélose Lactose) : C’est un milieu spécifique des coliformes. En effet le cristal violet inhibe la croissance des Gram + : ce qui rend le milieu sélectif des Gram -. L’indicateur coloré Rouge neutre permet de différencier les coliformes lactose + (coloration rouge foncé) des autres entérobactéries lactose – (coloration jaune). Le lactose apportant une source de carbone et les peptones apportant la source azotée. Les sels biliaires et les extraits de levures apportent les facteurs uploads/Geographie/ tp-de-microbio-des-produits-laitiers.pdf