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Evaluation in vitro de la sensibilité bactérienne au antibiotique Présentés par

Evaluation in vitro de la sensibilité bactérienne au antibiotique Présentés par: Hajar Rehane Oumaima Zazza Zaineb sifeddine Soukaina El houfadi Hanane Hamza Encadrée par: Mr. Bahlaoui PLAN I-Introduction II-Bactériostase 1 Définition 2-Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) 3-Détermination de la CMI III-Notion de Sensibilité/Résistance 1-Définition de la résistance 2-Détermination des catégories S/I/R 3-Etablissement des valeurs critiques délimitant les catégories cliniques 4- Relation avec la CMI IV-Notion de spectre V-Méthodes d’études in vitro A-Antibiogramme 1-Principe 2-Techniques classiques 3- Standardisation 4-Résultats 5-Autres techniques 6-Limites de l’antibiogramme B-Autres méthodes 1-Recherche des bêta-lactamases 2-Recherche de la méticillino-résistance chez les staphylocoques 3-Recherche des bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) 4-Apport de la biologie moléculaire VI-Cas particulier de l’antibiogramme automatisé VII-Epreuves de synergie VIII-Conclusion I-Introduction: Il faut garder à l’esprit qu’en pratique, on étudie l’effet des antibiotiques in vitro le plus souvent et dans des conditions normalisées de culture. Ainsi, il faut déterminer des corrélations afin de présumer de l’efficacité in vivo de l’antibiotique et donc de la réussite (ou de l’échec) du traitement sur la base de données biologiques in vitro. II-Bactériostase: 1-Définition: La bactériostase correspond à un ralentissement de la croissance d’une population bactérienne, pouvant aller jusqu'à l'arrêt de la croissance. Ceci ne vaut que si la bactérie était en phase de croissance avant le contact. Dans le cas contraire une absence de développement peut aussi correspondre à une augmentation très prononcée du temps de latence. Elle peut être étudiée en milieu liquide par exemple par un suivi photométrique de la croissance des microorganismes en présence de concentrations variées d'antibiotiques. 2-Concentration Minimale Inhibitrice = CMI: Le paramètre le plus souvent utilisé pour évaluer l’effet d’un antibiotique est la CMI. Elle correspond à la concentration minimale d’antibiotique qui inhibe la croissance visible du germe en 24H. La CMI explore donc l’effet bactériostatique seulement, (notons que son emploi n’est pas justifié chez un malade immunodéprimé). On note de bonnes corrélations biologico-cliniques de l'emploi de la CMI, qui est un bon prédicateur de l'efficacité de la thérapeutique antibiotique : Quand elle excède une certaine valeur l'échec thérapeutique est habituel : quand elle est inférieure à une autre valeur le succès est pratiquement assuré. Entre les deux valeurs précédentes, la prédiction est impossible 3-Détermination de la CMI: La CMI n'est pas, pour une bactérie donnée, une constante biologique. Elle est définie comme étant la plus faible concentration d’une gamme de dilutions d’antibiotique de demi en demi qui entraîne l’inhibition de toute croissance bactérienne visible. La méthode par dilution successive en milieu solide est la méthode de référence pour déterminer la sensibilité bactérienne aux antibiotiques. Cette détermination exige une standardisation rigoureuse du protocole expérimental (influence de l'Inoculum, de l’incubation, de la technique d’ensemencement, des antibiotiques à tester, de la lecture, du milieu de culture et des contrôles de qualité), toute modification des conditions expérimentales rend l’interprétation difficile. D’autres méthodes sont applicables : dilutions successives en milieu liquide (croissance bactérienne appréciée par l’apparition d’un trouble) ; E-Test (bandelettes imprégnées d’un gradient d’antibiotique). III-Notion de Sensibilité / Résistance: 1-Définition de la résistance: La résistance des bactéries aux antibiotiques est soit naturelle, soit acquise. La résistance naturelle d’une espèce ou d’un genre est :  Une caractéristique propre, concernant l’ensemble des souches de l’espèce ou du genre  Portée par un chromosome donc toujours transmissible à la descendance : transmission verticale  Un caractère permettant de définir le phénotype sauvage ou sensible de l’espèce La résistance acquise, pour sa part :  Ne concerne qu’une proportion plus ou moins importante, variable dans le temps  Résulte d’une modification génétique par mutation ou par acquisition de plasmides ou transposons, (résistance extra chromosomique) transmissible horizontalement, parfois entre espèces différentes  Définit des phénotypes « résistants ». Les résistances croisées s’expriment, elles, au sein d’une même classe d’antibiotiques et sont dues au même mécanisme de résistance. * 2-Détermination des catégories S/I/R: On a déterminé les valeurs critiques qui délimitent les catégories cliniques et de proposer un guide pour la détermination de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. Les valeurs critiques définies pour les concentrations et les diamètres des zones d'inhibition, ainsi que les recommandations spécifiques à certaines espèces ou à certains groupes d'antibiotiques Trois catégories cliniques ont été retenues pour l'interprétation des tests de sensibilité in vitro : Sensible (S), Résistant (R) et Intermédiaire (I). Les souches catégorisées S : sont celles pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutique est forte dans le cas d'un traitement par voie systémique avec la posologie recommandée Les souches catégorisées R: sont celles pour lesquelles il existe une forte probabilité d'échec thérapeutique quels que soient le type de traitement et la dose d'antibiotique utilisée. Les souches catégorisées I : sont celles pour lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible. Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in vitro ne sont pas prédictifs d'un succès thérapeutique. 3-Etablissement des valeurs critiques délimitant les catégories cliniques : La méthode par diffusion utilise la relation entre CMI et diamètre d’inhibition autour d’une source d’antibiotique, la lecture est donc relativement directe. Pour une bactérie et un antibiotique donnés, le diamètre d’inhibition mesuré est comparé aux diamètres critiques :  < au diamètre critique inférieur d, la souche est classée R.  >au diamètre critique supérieur D, la souche est classée S. Les diamètres critiques d et D correspondent respectivement aux concentrations critiques hautes C et basses c. Les valeurs des concentrations et des diamètres critiques sont définies pour chaque antibiotique. 4-Relation avec la CMI : Aux regards des concentrations et des diamètres critiques sont considérées comme : → Sensibles (S) : les souches pour lesquelles la CMI de l'antibiotique testé est ≤ à la concentration critique basse (c), ce qui équivaut à un diamètre ≥ au diamètre critique D → Résistantes (R) : les souches vis-à-vis desquelles la CMI de l'antibiotique testé est > concentration critique haute C, correspondant à un diamètre < diamètre critique d → De sensibilité intermédiaire (I) : les souches vis-à-vis desquelles la CMI de l'antibiotique testé et le diamètre correspondant sont compris entre les deux concentrations critiques et les deux diamètres critiques. Catégories CMI (mg/L) Diamètre (mm) Sensible CMI≤ c Diamètre ≥ D Résistant CMI > C Diamètre <d Intermédiaire c < CMI ≤C d ≤ Diamètre <D IV-Notion de spectre : À chaque antibiotique est associée une liste d'espèces bactériennes qui constitue le "spectre d'activité" de la molécule. Le spectre naturel, établi dans les premières études avant tout emploi en thérapeutique, reste stable par définition puisqu'il ne prend pas en compte la proportion de bactéries ayant acquis une résistance à l'antibiotique après son utilisation. Cette proportion augmente au cours du temps parce que l'emploi de l'antibiotique exerce la pression de sélection nécessaire à l'émergence de mutants ou de souches porteuses de facteurs extra chromosomiques de résistance. Cette notion doit être connue du clinicien car elle explique des situations d'apparence paradoxale : par exemple, le spectre naturel de la pénicilline G comprend Staphylococcus aureus alors qu’actuellement 90% des souches sont résistantes par production de pénicillinase. V-Méthodes d’étude in vitro: A-Antibiogramme: 1-Principe: L'antibiogramme a pour but de déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) d'une souche bactérienne vis-à-vis de divers antibiotiques. Le principe consiste à placer la culture de bactéries en présence d’un ou des antibiotiques et à observer les conséquences sur le développement et la survie de celle-ci. On peut par exemple placer plusieurs pastilles imbibées d'antibiotiques sur une souche bactérienne déposée dans une boîte de Petri. Il existe trois types d'interprétation selon le diamètre du cercle qui entoure le disque d'antibiotique : souche ou bactérie sensible, intermédiaire ou résistante. 2-Techniques classiques : Méthodes de dilution Les méthodes de dilution sont effectuées en milieu liquide ou en milieu solide. Elles consistent à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes d'antibiotiques selon une progression géométrique de raison 2. En milieu liquide (figure 1), l'inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode de macrodilution) ou de cupules (méthode de microdilution) contenant l'antibiotique. Après incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus faible concentration d'antibiotique où aucune croissance n'est visible. Figure 1 : Détermination de la CMI par dilution en milieu liquide. En milieu solide (figure 1bis), l'antibiotique est incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Petri. La surface de la gélose est ensemencée avec un inoculum des souches à étudier. Après incubation, la CMI de chaque souche est déterminée par l'inhibition de la croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d'antibiotique. La méthode de dilution en milieu gélosé, réalisée avec une gamme de concentrations en progression géométrique de raison 2 est la méthode de référence. Figure 1bis : Détermination de la CMI par dilution en milieu gélosé. La CMI de la souche 3 vis-à-vis de l'antibiotique incorporé à la gélose est de 1µg/mL. La CMI de la souche 2 est de 2 µg/mL. Les déterminations des CMI des souches 1 et 4 nécessiteraient de tester des concentrations croissantes plus fortes en antibiotique. Méthodes de diffusion : antibiogramme standard Les méthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont uploads/Geographie/ tf-90002013.pdf