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Objectif de TP : savoir les différents types des milieux de culture et leur cla

Objectif de TP : savoir les différents types des milieux de culture et leur classification + préparation d’un milieu GN (gélose nutritive) et un autre BN (bouillon nutritif) Introduction : L’étude des bactéries a connu son plein développement à partir du moment où furent mises au point des méthodes permettant de les cultiver, les isoler, et de les identifier. Ces différentes opérations nécessitent l’emploi de milieux de culture. Le matériel utilisé : a) Echantillon étudié : / b) Petit matériel : anse de platine, erlenmeyer de 500ml + un barreau magnétique, boites de pétri, pipette de 10 ML, 20 tubes à essai, des flacons étiquetés , papier indicateur de PH , bécher de 200ML (pour préparation de l’eau physiologique) c) Gros matériel : une balance de laboratoire , plaque chauffante , autoclave, étuve Principales caractéristiques d’un milieu de culture Les microorganismes doivent trouver dans le milieu de culture et son atmosphère tous les éléments chimiques les constituant, sous une forme appropriée. Un bon milieu doit:  Etre stérile  Etre nutritif : doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la croissance et l’entretien des microorganismes.  Avoir un pH convenable. Classification des milieux de culture Les milieux de culture sont classés en fonction de leur composition ou de leur croissance. a) Classification selon la composition. 1. Milieux naturels ou empiriques Milieux complexes de composition mal définie. Leur origine est soit animale (extraits de viande, peptone), soit végétale (pomme de terre, levure). 2. Milieux synthétiques Milieux composés de substances chimiques exactement définies 3. Milieux semi synthétiques Milieux synthétiques additionnés d’un produit naturel b) Classification selon la croissance (l’utilisation) 1. Milieu usuels = milieu de base Milieu d’un emploi aussi général que possible. Il n’existe cependant pas de milieu de culture universel 2. Milieu d’isolement Les milieux d’isolement peuvent être :  Des milieux de base  Des milieux enrichis de produits biologiques  Des milieux électifs : Ce sont des milieux de culture permettantun développement particulièrement abondant de certains germes.  Des milieux sélectifs (ou d’enrichissement) : Ce sont des milieux dans lesquels on incorpore un inhibiteur chimique. Celui-ci, judicieusement choisi, entrave le développement de la plupart des bactéries excepté celui de l’espèce recherchée. Ces milieux permettent donc d’isoler une espèce bactérienne au milieu d’un mélange de germes.  3. Milieu d’identification : Ces milieux permettent la mise en évidence des caractères biochimiques et donc de résoudre les problèmes d’identification différentielle qui se posent entre des espèces ou des genres voisins. c) Classification selon leur présentation 1. Milieux liquides : ce sont soit des bouillons nutritifs contenant des produits carnés ou protéiques, soit des solutions riches en produits synthétiques. Dans les deux cas la gélose est totalement absente. La croissance microbienne est réalisée dans des tubes, des ballons ou des erlenmeyers. Elle est suivie par turbidimétrie : un milieu limpide au départ devient de plus en plus trouble lorsqu’un microorganisme développe. 2. Milieux solides : Les milieux nutritifs solides peuvent être identiques aux précédents mais ils contiennent de la gélose. Sil y a plus de 1% d’agar on parle de milieu solide, si il y a moins de 1% d’agar on parle de milieu semi solide. Ces milieux peuvent être répartis en boîtes de pétri, dans des tubes à gélose molle prise en culot, etc. La croissance microbienne se déroule en surface ou en profondeur et est suivie par observation de l’augmentation de la taille des colonies respectivement aérobies et anaérobies. Une cellule initiale se multiplie et donne une descendance de plusieurs millions d’individus tous identiques, formant une colonie. Les milieux utilisés durant ce Tp, leur rôle et leur préparation : Durant ce Tp nous avons utilisé :Un milieu empirique sous forme solide: Gélose nutritive (GN)Un milieu empirique sous forme liquide : Bouillon nutritif (BN)Deux milieux sélectifs : Milieu à l’éosine et bleu de méthylène (EMB), Milieu Malt agar (MA)De l’eau physiologiqueGélose nutritive (GN):Relativement simplifiée, sa formulation apporte les éléments nutritifs nécessaires à la croissance d’unegrande variété de germes non exigeants. Elle est utilisée pour la culture et la numération desmicroorganismes ne présentant pas d’exigences particulières.Elle est constituée :- e x t r a i t d e l e v u r e - bouillon nutritif (nutrient broth)- g l u c o s e - a g a r Nous avons pesé 20g de BN, 3g d’extrait de levures, 5g de glucose, que nous avons placés dans un erlende 2L et auxquels nous avons ajouté 1L d’eau déminéralisée et placé sous agitation avec un barreauaimanté afin de dissoudre les différents constituants. Nous avons alors vérifié que le pH se situait biendans une gamme comprise entre 7 et 7.5. C’est donc après la dissolution des différents éléments dumilieu et ajustage du pH que nous avons incorporé les 15g d’agar. Nous avons alors bouché l’encolure del’erlen avec du coton cardé et placé une feuille d’aluminium autour avant de stériliser le milieu àl’autoclave à 121°c pendant 20 min.Bouillon nutritif (BN) :Le bouillon nutritif contient exactement les mêmes constituants que la gélose nutritive, excepté le faitqu’on n’ajoute pas d’agar puisque c’est un milieu liquide. Il est donc constitué de :- e x t r a i t d e l e v u r e - bouillon nutritif (nutrient broth)- g l u c o s e Sa préparation est identique à celle de la gélose nutritive.Gélose EMB (éosine methylen bleu) :La gélose EMB est constituée d’éosine Y et de bleu de méthylène qui sont des agents faiblementsélectifs. Ils n’inhibent que partiellement le développement des microorganismes gram positifs tels queles Streptocoques fécaux. De plus ces colorants assurent la différenciation entre les germes lactosepositifs et les germes lactose négatifs, lorsque le milieu est lactosé.Nous avons pesé 18.75g afin de préparer 500 mL de ce milieu, auxquels nous avons ajouté 500 mL d’eaudéminéralisée. On a alors ajusté le pH à 6.8-7 à l’aide de KOH concentré et stérilisé à 121°c pendant 20min suivant le même protocole que précédemment. 5 Gélose Malt agar :Elle est constituée :- e x t r a i t d e m a l t - e x t r a i t d e l e v u r e - g l u c o s e - a g a r Nous avions à notre disposition sous forme de poudre la base du milieu malt agar qui contenait tous lesconstituants sauf l’extrait de levure et le glucose. Le fabricant indiquait qu’il fallait peser 45g pourpréparer un litre. Nous voulions préparer 500 mL, nous pesions par conséquent 22.5g sur une feuilled’aluminium. Nous avons également pesé 1.25g d’extrait de levure et 5g de glucose. Après avoir pesé tousles constituants nous les avons transférés dans un erlen d’un litre et ajouté 500 mL d’eau déminéralisée.Nous avons ensuite rajouté 0.25g de Cloramphénicol avant de stériliser à 121°C pendant 20 min.La sélection des levures se réalise par l’emploi du chloramphénicolL’eau physiologique :Elle est obtenue par dissolution de 9g de Chlorure de sodium (NaCl) par litre d’eau distillée. Elleconstitue un milieu isotonique qui permettra la dissolution des microorganismes tout en maintenant ladifférence de pression osmotique de part et d’autre de la membrane plasmique évitant ainsi la lyse.Après stérilisation nous avons procédé à l’étape de répartition des milieux. Nous avons coulé les gélosesde façon stérile à proximité de la flamme du bec Bunzen. 6 Familiarisation avec le monde microbien Les Techniques de préparations microscopiques L’observation microscopique des microorganismes peut se faire sans coloration ou après coloration.Dans le premier cas, on examine des individus vivants : on apprécie ainsi la mobilité, la taille, la forme desgermes ; dans un second cas, on précise la forme et on détaille les structures invisibles, par coloration,après fixation et desséchage des préparations, opérations tuant les germes. Observation sans coloration : Etat frais L’observation de l’état frais se réalise à l’objectif x40, le condenseur descendu, et le diaphragmelégèrement fermé. On observe ainsi sur un fond grisâtre des bactéries brillantes. On met à profit lapropriété de réfringence des microorganismes pour les observer vivants.1) Technique opératoireLa technique opératoire consiste à préparer une lame propre dégraissée et sèche.Homogénéiser la suspension à observer : prélever aseptiquement à la Pipette Pasteur une goutte deculture : déposer cette goutte au centre de la lame.Rq : Si on part d’un produit solide comme une colonie sur une boite de pétri par exemple, on déposerad’abord une goutte d’eau au centre de la lame et on y suspendra une faible quantité de la colonie à l’aidede l’ose.On recouvrira ensuite la goutte d’une lamelle tout en évitant les bulles d’air et les débordements deliquide au-delà de la zone délimitée par la lamelle.On observera sur fond clair avec l’objectif 40. 7 2) InterprétationCette préparation permet d’apprécier :  Le nombre de bactéries contenues dans le prélèvement ; notion semi quantitative permettant dedire s’il y a beaucoup ou peu de germes (renseignement utile ultérieurement pour choisir laquantité d’inoculum convenable pour l’observation d’un bon isolement et d’une bonne culture).  La forme des bactéries  Coques ou cocci : éléments arrondis, sphériques.  Bacilles : bâtonnets : éléments allongés de taille variable.Bacilles uploads/Geographie/ tp1-de-systematique.pdf