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INSTITUT PASTEUR D’ALGERIE COURS NATIONAL D’HYGIENE ET DE MICROBIOLOGIE DES ALI

INSTITUT PASTEUR D’ALGERIE COURS NATIONAL D’HYGIENE ET DE MICROBIOLOGIE DES ALIMENTS UNITE : « MICROBIOLOGIE DES LAITS ET PRODUITS LAITIERS » MANUEL DES TRAVAUX PRATIQUES du 19 au 30 Octobre 2002 Responsable des TP : Dr LEBRES – IPA Assistants : Mr Azizi Djamal Mr Hamza Abdenour Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 2 M E T H O D E S G E N E R A L E S I . PREPARATION DES ECHANTILLONS . I.1. Prise d’essai . Les laits étant des produits liquides constitueront d’emblée donc une solution mère. Les produits laitiers ( laits secs en poudre, yaourt, fromages, desserts lactés et autres étant des produits solides, feront l’objet de dilutions décimales, mais au préalable il est nécessaire de procéder à leur homogénéisation à l’aide de techniques et d’appareils appropriés (Broyeurs homogénéisateurs, Stomatcher ..) . Les prises d’essai sont effectuées sur l’échantillon homogénéisé en tenant compte de deux facteurs essentiels à savoir :  le nombre de pièces soumises à l’analyse d’une part,  les opérations analytiques à conduire ... Mais, en général, on prélève trois fois 25 ml ou 25 gr :  les premiers serviront à l’analyse bactériologique courante,  les seconds serviront à la recherche de Salmonella – Shigella,  les troisièmes serviront à la recherche des Listeria. I.2. Cas des produits liquides. Dans le cas des produits liquides, le mélange de trois à cinq sachets de lait par exemple constituera la solution mère (SM = 1). Dilutions décimales :  Introduire ensuite aséptiquement à l’aide d’une pipette en verre graduée et stérile, 1 ml de la SM, dans un tube à vis stérile contenant au préalable 9 ml du même diluant : cette dilution est alors au 1/10 ou 10-1.  Introduire par la suite 1ml de la dilution 10-1 dans un tube à vis stérile contenant au préalable 9 ml du même diluant : cette dilution est alors au 1/100 ou 10-2 .  Introduire ensuite aseptiquement à l’aide d’une pipette en verre graduée et stérile, 1 ml de la dilution 10-2 dans un tube à vis stérile contenant au préalable 9 ml du même diluant ; cette dilution est alors au 1/1000 ou 10-3 . Voir schéma n°1. I.3.Cas des produits solides. Dans le cas des produits solides, introduire aseptiquement 25 grammes de produit à analyser dans un bocal stérile préalablement taré ou dans un sachet stérile de type « Stomatcher » contenant au préalable 225 ml de diluant soit le TSE ( Tryptone Sel Eau ) . Homogénéiser. Cette suspension constitue alors la dilution mère (DM) qui correspond donc à la dilution 1/10 ou 10-1. Dilutions décimales :  Introduire ensuite aseptiquement à l’aide d’une pipette en verre graduée et stérile 1ml de la DM, dans un tube à vis stérile contenant au préalable 9 ml du même diluant : cette dilution sera alors au 1/100 ou 10-2.  Introduire par la suite 1ml de la dilution dans un tube à vis stérile contenant au préalable 9 ml du même diluant : cette dilution est sera alors au 1/100 ou 10-3.  Introduire ensuite aseptiquement à l’aide d’une pipette en verre graduée et stérile, 1 ml de la dilution 10-3 dans un tube à vis stérile contenant au préalable 9 ml du même diluant : cette dilution est alors au 1/1000 ou 10-4 . Voir schéma n°2. Ces dilutions serviront à la recherche des germes suivants :  Germes aérobies mésophiles totaux  Coliformes totaux et fécaux  Staphylococcus aureus  Levures et Moisissures. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 3 Remarques : 1. Au moment de la réalisation des dilutions décimales, il est impératif de changer de pipettes entre chaque dilution. 2. Contrairement à cela, lors de l’ensemencement il est recommander de commencer par la plus forte dilution à savoir 10-3 dans le but justement de ne pas changer de pipettes. On travaillera alors à l’aide d’une pipette graduée en verre stérile de 5 ml. 1 ml 1 ml 9 ml 9 ml LAIT TSE TSE SM: 1 10-1 10-2 Schéma n°1 : Cas des Produits Liquides. 1 ml 1 ml 25 gr 9 ml 9 ml dans TSE TSE 225 ml TSE DM:10-1 10-2 10-3 Schéma n°2 : cas des Produits Solides TP : 1 Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux A partir des dilutions décimales allant de 10-3 à 10-1 voire 1, porter aseptiquement 1 ml dans une boite de Pétri vide préparée à cet usage et numérotée comme l’indique le schéma n°3. Compléter ensuite avec environ 20 ml de gélose PCA ou TDYM fondue puis refroidie à 45±1°C : le choix des milieux dépend de la nature des denrées à analyser. Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose utilisée. Laisser solidifier sur paillasse, puis rajouter une deuxième couche d’environ 5 ml de la même gélose ou de gélose blanche. Cette double couche a un rôle protecteur contre les contaminations diverses. Incubation : Les boites seront incubées couvercle en bas à 30°C pendant 72 heures avec : - première lecture à 24 heures, - deuxième lecture à 48 heures, et - troisième lecture à 72 heures. Lecture : Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 4 Les colonies des G A M T se présentent sous forme lenticulaire en masse. Dénombrement : Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des facteurs suivants : - ne dénombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies, - multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution, - faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions. Illustration : Inoculum Nbre de Colonies Pour revenir à 1 Nbre réel Moyenne arithmétique 10-1 160 X 10 1600 10-2 70 X 100 7000 10-3 19 X 1000 19 000 27600 / 3 = 9200 GAMT/gr TP : 1 Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux A partir des dilutions décimales : 10-1 10-2 10-3 1 ml 1ml 1ml - Ajouter environ 20 ml de gélose TDYM - Laisser solidifier sur paillasse - Ajouter une double couche (5 ml) - Incuber à 30°C, 24 – 48 et 72 h - Dénombrer les colonies lenticulaires en masse. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 5 TP : 2 Recherche et dénombrement des Coliformes en milieu liquide Dans les laits et produits laitiers, les Coliformes sont dénombrés :  soit en milieu liquide par la technique du NPP (nombre le plus probable) à l’aide du bouillon VBL (bouillon lactosé bilié au vert brillant) réparti à raison de 10 ml par tubes munis d’une cloche de Durham.  soit en milieu solide, sur le milieu au Désoxycholate à 1‰. La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :  le test de présomption : réservé à la recherche des Coliformes totaux.  le test de confirmation : appelé encore test de Mac Kenzie et réservé à la recherche des Coliformes fécaux à partir des tubes positifs du test de présomption.  Test de présomption. Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif (VBL) à raison de trois tubes par dilution. A partir des dilutions décimales 10-3 à 10-1, porter aseptiquement 1 ml dans chacun des trois tubes correspondant à une dilution donnée comme l’indique le schéma n°4. Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélanger le milieu et l’inoculum. Incubation : L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures. Lecture : Sont considérés comme positifs les tubes présentant à la fois :  un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche ),  un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune (ce qui constitue le témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu). Ces deux caractères étant témoins de la fermentation du lactose dans les conditions opératoires décrites. La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table de Mac Grady qui se trouve en annexe. Illustration : Inoculum V B L. Test de Présomption Nbre Caractéristique 10-1 + + + 3 10-2 + + - 2 10-3 - - + 1 Le nombre caractéristique est donc « 321 » ; ce qui correspond sur la table de Mac Grady au nombre 15. On considère alors qu’il y a 15 Coliformes par gramme de produit à la dilution 10-1. Pour obtenir le nombre réel de Coliformes totaux, il suffit de multiplier ce nombre par l’inverse de la première dilution pour revenir à 1 soit : 15 X 10 = 150 Coliformes totaux par gr de produit à analyser.  Test de confirmation ou test de Mac Kenzie. Les tubes de VBL trouvés positifs lors du dénombrement des Coliformes totaux feront l’objet d’un repiquage à l’aide d’une uploads/Industriel/ manuel-des-tp-laits-4.pdf