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S M.. Meftah C.Q.F.A -République Algérienne Démocratique et Populaire Bureau d’

S M.. Meftah C.Q.F.A -République Algérienne Démocratique et Populaire Bureau d’hygiène Nedroma 2011 1 GUIDE PRATIQUE D’ANALYSES MICROBIOLOGIQUES DES DENREES ALIMENTAIRES Selon Institut pasteur d’Algérie Service de Bactériologie alimentaire Version Janvier 1999 Rédiger par :  S.M. MEFTAH * TS Fabrication Agroalimentaires. Option : Contrôle de qualité * Bureau d’hygiène Nedroma Chef de service : Technicien du laboratoire: S M.. Meftah C.Q.F.A 1. Préparation des échantillons : 1.1. Prise d’essai : Les prise d’essai sont effectuées sur l’échantillon homogénéisé en tenant compte de plusieurs facteur a savoir : * la nature de produit * Le nombre d’échantillons * Les opération analytiques a conduire……….. 1) Prélèvement en surface : -Méthode Ecouvillonnage : Un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une solution stérile de Ringer au 1/4 ou dans un bouillon tryptone-sel additionné de Tween (0,5°/°°). Le prélèvement est effectué par frottement sur la surface du produit ; l’écouvillon est alors immergé dans 10 ml de Ringer au 1/4 ou 10 ml de bouillon tryptone-sel. L’analyse est réalisée à partir de la suspension ainsi obtenue. Schéma 1 : Prélèvement en surface (Méthode Ecouvillonnage) 2) Prélèvement de produits liquides : La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut néanmoins toujours s’assurer de la parfaite homogénéisation du liquide (agitateurs) avant de prélever à la pipette (ou avec un flacon lesté stérile ou autre) le volume nécessaire à l’analyse. 3) Prélèvement de produits solides : Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde (fromages et produits mous) ou à la pipette harpon. La surface est souvent éliminée avant de procéder au prélèvement. Si le produit est hétérogène (plats cuisinés, conserves etc.) il faut s’assurer de la bonne représentativité du prélèvement. * En générale, en prélèvement deux fois 25 gramme : Les premières serviront a l’analyse bactériologique courante Les seconds serviront à la recherche de salmonella Bureau d’hygiène Nedroma 2011 2 S M.. Meftah C.Q.F.A 1.2. Suspension mère et dilution décimales : 1.2.1. Cas des produits solides: Exemple : Viande, produit carnés, fromages,….. Instruire aseptiquement 25 g de produit a analysée dans un flacon préalablement taré ou dans un sachet stérile de type < Stomatcher> contenant au préalable 225 ml de diluant soit le TSN (Tryptone Sel Eau). Homogénéiser Cette Suspension constitue alors la dilution mère (DM) qui correspond donc a la dilution 1/10. Instruire ensuite aseptiquement à l’aide d’une pipette en verre graduée et stérile, 1ml de la DM dans un tube a vis contenant au préalable 9 ml du même diluant ; cette dilution est alors 1/100…ainsi de suite jusqu’un l’obtention de la dilution 1/100000 soit 10-5 . (Schéma n°2) 1.2.2. Cas des produits Liquides : Exemple : Lait pasteurisé, ……. Procèdes de façon aseptique au mélange de quelques sachets (5 en moyenne) pris au hasard parmi le lot de lait à analyser, dans un erlenmeyer stérile. Ce mélange constitue donc la solution mère (SM). Suivront ensuite les dilution décimales de la même manière que dans le cas des produit solides, tout en considérant la SM a 1, la première dilution sera donc au 1/10. (Schéma n°3) Remarques : Au moment de la réalisation des dilution décimales, il impératif de changer de pipettes entre cheque dilution. Contrairement à cela, lors de l’ensemencement, il est recommander de commencer par la plus haute dilution dans le but justement de ne pas changer de pipettes. On travaillera alors à l’aide d’une pipette graduée en verre stérile de 5ml. Bureau d’hygiène Nedroma 2011 3 (DM) 9 ml de TSE 25g + 225ml de TSE 1ml 1ml 10-2 10-3 10-4 10-1 (SM) 9 ml de TSE Mélange de Liquide 1ml 1ml 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml S M.. Meftah C.Q.F.A Schéma 2 : Suspension mère et dilution décimales Cas des produits solides: Schéma 3 : Suspension mère et dilution décimales Cas des produits liquides: Bureau d’hygiène Nedroma 2011 4 S M.. Meftah C.Q.F.A 2. METHODES DE RECHERCHE ET DENUMERATION 2.1. Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux:  Ils sont présents dans les aliments à la faveur d'un couple temps / température favorable à leur croissance.  Germes (= microbes = bactéries + levures + moisissures) qui se développent en présence d'air (aérobie) à température moyenne (mésophile: 25 – 30°C). Ces caractéristiques sont celles de la méthode d'analyses en laboratoire. Elles correspondent à des conditions optimales de développement de ces germes, appelés aussi germes d'altération. Pouvoir pathogène: Bien que, pour la plupart des espèces, ces bactéries ne soient pas dangereuses pour la santé, leur détection dans les aliments traduit une altération. Elle amoindrit la qualité intrinsèque de la denrée (goût, odeur, aspect). Technique: A partir des dilutions décimales allant de 10-3 à 10-1 voire 1, porter aseptiquement 1 ml dans une boite de Pétri vide préparée à cet usage Compléter ensuite avec environ 20 ml de gélose PCA ou TDYM fondue puis refroidie à 45±1°C Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose utilisée. Laisser solidifier sur paillasse, puis rajouter une deuxième couche d’environ 5 ml de la même gélose ou de gélose blanche. Ce double couche à un rôle protecteur contre les contaminations diverses. (Schéma n°4) Incubation : Les boites seront incubées couvercle en bas à 30°C pendant 72 heures avec : - première lecture à 24 heures, - deuxième lecture à 48 heures, et - troisième lecture à 72 heures. Lecture : Les colonies des G A M T se présentent sous forme lenticulaire en masse. Dénombrement : Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des facteurs suivants : - ne dénombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies, - multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution, - faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions Bureau d’hygiène Nedroma 2011 5 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml PCA PCA PCA 20ml de gélose PCA ou TDYM S M.. Meftah C.Q.F.A  Laisser solidifier sur paillasse  Ajouter une double couche (5 ml)  Incuber à 30°C, 24 – 48 et 72 h  Dénombrer les colonies lenticulaires en masse. Schéma 4:Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles. Bureau d’hygiène Nedroma 2011 6 S M.. Meftah C.Q.F.A 2.2. Recherche et dénombrement des coliformes totaux et coliforme fécaux:  Coliformes : Il s’agit de Bacilles Gram Négatifs (BGN), aérobies ou anaérobies facultatifs, non sporulés, ne possédant pas d’oxydase, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec production d’acide et de gaz en 24 à 48 heures à une température comprise entre 36 et 37°C, selon l’ISO.  Coliformes Thermo-tolérants : Il s’agit là de coliformes possédant les mêmes caractéristiques que les coliformes mais à 44°C ; ils remplacent dans la majorité des cas l’appellation de «Coliformes fécaux ». Escherichia coli: Il s’agit là de coliformes Thermo-tolérants qui produisent, en outre, de l’indole à partir du tryptophane à 44°C. Pouvoir pathogène: Les coliformes étant des bactéries vivant dans les intestins d'animaux ou humains, leur présence dans l'aliment indique une pollution fécale. Ce sont donc des organismes indicateurs de la qualité de l'aliment. Ils ne provoquent pas d'intoxication sauf Escherichia coli En Milieu Solide : Technique: A partir des dilutions décimales allant de 10-3 à 10-1, porter aseptiquement 1 ml de chaque dilution dans deux boites de Pétri vides préparées à cet usage et numérotées comme l’indique le Schéma n°5 Compléter ensuite chaque boite avec environ 20 ml de la gélose VRBL, fondue puis refroidie à 45±1°C. Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour permettre à l’inoculum de bien se mélanger à la gélose utilisée. Incubation : Une série de boites sera incubée à 37°C, pendant 24 à 48 h et servira à la recherche de Coliformes totaux, L’autre série sera incubée à 44°C pendant 24 à 48 h et servira à la recherche de Coliformes fécaux. Dénombrement : Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des facteurs de dilutions, de plus : - ne dénombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies, - multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution, - faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions. Bureau d’hygiène Nedroma 2011 7 S M.. Meftah C.Q.F.A - il est impossible de trouver plus de Coliformes fécaux que de Coliformes totaux. Que se soit à 37 ou à 44°C, les premières lectures se feront au bout de 24 h et consistent à repérer les petites colonies rouges ayant poussé en masse mais fluorescentes, ce qui signifie que la lecture doit se faire dans une chambre noire et sous une lampe à UV. Les autres colonies non fluorescentes ne sont ni des coliformes totaux ni des coliformes fécaux. Bureau d’hygiène Nedroma 2011 8 1ml 1ml 1ml 10-1 10-2 10-3 20ml de VRBL 20ml de VRBL 20ml de VRBL 20ml de VRBL 20ml de uploads/Industriel/ quide-pratique-d-u2019analyses-microbiologiques.pdf