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Master I Biochimie App Module Biochimie et Biotechnologies Cours (SNV-Adrar) BO

Master I Biochimie App Module Biochimie et Biotechnologies Cours (SNV-Adrar) BOUZEKRI. A 13 III. Production de protéines recombinantes en système acellulaire : Industrialisation et réglementation Introduction : Le système de production de protéine par synthèse acellulaire est une technique développée pour la première fois en 1961. Il a été utilisé majoritairement comme outil de recherche sur les mécanismes de synthèse de protéines et dans le domaine de la protéomique. C’est une technique complexe utilisant la machinerie transcriptionnelle et traductionnelle de la cellule afin de produire une protéine particulière à partir d’une information génétique spécifique. Ce système a été très peu utilisé en tant que méthode de production de protéines thérapeutiques à l’échelle industrielle à cause de son faible rendement et des forts coûts associés à son fonctionnement. Mais les recherches effectuées ces quinze dernières années ont permis de développer cette technique et de l’amener à un niveau de maturité comparable à celui des systèmes cellulaires actuellement utilisés en industrie. III.1. Historique : Les grandes dates du développement de la synthèse de protéines par système acellulaire : 1950 : première utilisation de lysats cellulaires (destruction de membranes cellulaires) pour synthèse protéique. 1961 : premier système acellulaire utilisant un message exogène (ARNm ou polyribonucléotides synthétiques ; Niremberg et Matthaei 1961) 1967 : premier système couplé de transcription/traduction utilisant de l’ADN et non de l’ARNm (DeVries et Zubay, 1967) 1975 : première utilisation d’ARN polymérase exogène pour synthèse protéique (Roberts and al. 1975) 1988: premier Continuously Fed Cell-Free (CFCF, Spirin, Science 242:1162-1164) 1995: premier Continuous-Exchange Cell-Free (CECF, Alakhov and al., Brevet #5,478,730) 2000 : première commercialisation de kits de surexpression utilisant le système CECF (RTS, Roche diagnostics). Master I Biochimie App Module Biochimie et Biotechnologies Cours (SNV-Adrar) BOUZEKRI. A 14 III.2. Système acellulaire : La technique de production de protéines recombinantes par système acellulaire est en constante évolution depuis 1950. En effet plus la technologie avance plus on entrevoit l’énorme potentiel de cette technique et les possibles applications qui en découlent. La multitude de facteurs sur lesquels il est possible de jouer montre que la recherche est encore loin d’avoir atteint les limites du système. Figure 1: Etapes clés de la technique de production de protéines en acellulaire Les premiers systèmes acellulaires étaient utilisés uniquement dans le but de traduire l’ARNm en protéine. Avec l’évolution de la technologie, de plus en plus de chercheurs ont développé des techniques permettant d’utiliser l’ADN comme matériel génétique. Mais selon le type de cellule utilisée afin de produire le lysat, le couplage de ces phases pourra être possible (E. coli) ou impossible, et intéressant ou pas selon la quantité à produire et le type de protéines attendu. On appelle alors « couplés », les systèmes permettant de produire la protéine en une seule étape à partir de l’ADN. La majorité des systèmes acellulaires procaryotes appartiennent à cette catégorie, les étapes de transcription et de traduction étant couplées chez les procaryotes. Les ARNm des organismes eucaryotes nécessitant une maturation post-transcriptionnelle, les techniques acellulaires eucaryotes passent de l’ADN à la protéine en 2 étapes, on parle de systèmes « liés » (fig. 2). Aucun « gold standard » n’a à ce jour été défini, chaque système dispose de points forts et de faiblesses. Master I Biochimie App Module Biochimie et Biotechnologies Cours (SNV-Adrar) BOUZEKRI. A 15 Figure 2: Systèmes liant ou couplant les mécanismes de transcription et de traduction, d’après le site internet de thermo Scientific™ III.2.1. Transcription : Ce mécanisme se déroule en trois étapes chez les procaryotes et les eucaryotes: initiation, élongation et terminaison. L'initiation de la transcription se produit lorsque l'ADN double-brin est déroulé afin de permettre la liaison à l'ARN polymérase. Une fois que la transcription est initiée, l'ARN polymérase est libéré de l'ADN. Figure 3 : Mécanisme de transcription, d’après site internet de Frontiers in genetics Master I Biochimie App Module Biochimie et Biotechnologies Cours (SNV-Adrar) BOUZEKRI. A 16 La transcription est régulée à différents niveaux par des activateurs et des répresseurs, mais aussi par la structure de la chromatine chez les eucaryotes. Chez les procaryotes, aucune modification post-transcriptionnelle spécifique des ARNm n’est nécessaire. Cependant, chez les eucaryotes, l'ARNm doit encore subir plusieurs modifications : éliminer les introns (épissage), fixer une coiffe (M7 méthyl-guanosine) à l'extrémité 5’ et ajouter des motifs adénine répétés afin de former une queue poly(A) en 3’ pour ainsi éviter la dégradation précoce de l’ARNm. Il est ensuite exporté vers le cytoplasme où il sera traduit. Dans le cas d’un système couplé ou lié, l’information génétique est présenté sous forme d’ADN, mais selon la technique employée et la nature eucaryote ou procaryote de la cellule base, différentes séquences complémentaires (promoteur, séquence initiatrice, terminateur,…) doivent être ajoutées à la séquence codant pour la protéine d’intérêt. Les séquences d’ADN complètes peuvent être obtenues de cultures cellulaires de plasmides bactériens afin de cloner et d’amplifier l’ADN qui sera ensuite purifié, ou encore produit par des techniques de Polymerase Chain Reaction (PCR). Afin d’être transcrit un ADN codant doit avoir en amont de sa séquence une séquence promoteur permettant la liaison de l’ARN polymérase et l’initiation de la transcription. La plus grande avancée au niveau de la transcription fut l’introduction en amont de la séquence codant un promoteur spécifique de l’ARN polymérase, d’un bactériophage et de supplémenter le lysat avec cette ARN polymérase de phage. L’utilisation de cette polymérase permet de transcrire uniquement les séquences codantes précédées du promoteur spécifique de la polymérase de phage. L’ARN polymérase de phage a un rendement de transcription bien supérieur à la polymérase endogène, l’addition de Rifampicine au lysat (dans le cas d’un système bactérien) permet d’inhiber la polymérase endogène et donc d’éviter d’avoir à éliminer l’ADN endogène et cette polymérase peut être utilisée sur des produits PCR ou des séquences d’ADN issues de plasmides. Plusieurs types d’ARN polymérase de phage ont été testés et 3 ont montré une efficacité accrue : la T7 RNA pol, la T3 RNA pol et la SP6 RNA pol. Ces polymérases sont les principales que l’on retrouve actuellement sur le marché. Master I Biochimie App Module Biochimie et Biotechnologies Cours (SNV-Adrar) BOUZEKRI. A 17 III.2.2. Aminoacylation: L'estérification de l'acide aminé spécifique à l'extrémité 3'-OH de l'ARNt est une étape clef du décodage du code génétique. On appelle cette étape l'aminoacylation et, dans toutes les cellules vivantes, il existe une vingtaine d'enzymes, les aminoacyl-ARNt synthétases, dont la fonction est de catalyser cette étape. Figure 4 : Mécanisme d’aminoacylation, d’après Drug News Perspect 2006, 19(6): 347 L'aminoacylation comprend deux étapes: l'activation de l'acide aminé par adénylation et la formation du lien ester entre l'acide aminé et l'hydroxyle 2' ou 3' du ribose du nucléotide 3' de l'ARN de transfert. Après ces deux étapes, l'ARN de transfert est prêt à amener son acide aminé spécifique vers le ribosome et l'ARN messager. Beaucoup d’études ont été réalisées dans le but de permettre l’incorporation d’acides aminés non naturels (mutants, artificiels ou n’appartenant pas au type d’extrait cellulaire utilisé) afin de marquer et détecter les protéines produites grâce à des acides aminés synthétiques par les moyens actuels (fluorescents, radioactifs, fonctionnalisés, puces à protéines…fixés en C-ter, N-ter ou à une autre position de la séquence peptidique). III.2.3. Traduction : Le mécanisme de traduction de l’ARNm en polypeptide est divisé en trois étapes : Une étape d’initiation où les deux sous-unités du ribosome vont s’assembler et se fixer au codon initiateur de la séquence de l’ARNm. Les ARNt fixés à leur acide aminé vont être recrutés par le ribosome et la synthèse peptidique va commencer. Master I Biochimie App Module Biochimie et Biotechnologies Cours (SNV-Adrar) BOUZEKRI. A 18 Une étape d’élongation où le ribosome va parcourir le brin d'ARNm codon par codon (translocation) et va, par l'intermédiaire d'un ARNt, ajouter un acide aminé à la protéine en cours de fabrication selon le codon lu. Une étape de terminaison : une fois la séquence ribonucléotidique entièrement lue et le codon stop atteint, le ribosome va se détacher du brin d’ARNm et du polypeptide néo-synthétisé. L’ARNm pourra alors être traduit de nouveau et le polypeptide sera alors dirigé vers d’autres localisations afin de subir d’autres modifications ou d’être utilisé tel quel par la cellule. Figure 5 : Mécanisme de traduction de l’ARNm en protéine, d’après le site internet de frontiers in genetics Par contraste avec la machinerie transcriptionnelle, le mécanisme de traduction implique un trop grand nombre de composants complexes pour pouvoir supplémenter le milieu réactionnel en molécules individuelles purifiées. En effet, pour améliorer les rendements en protéines, les extraits sont généralement complétés par des acides aminés et une source d'énergie pour alimenter l'expression des protéines. Au début des systèmes acellulaires eucaryotes de traduction seule, les chercheurs utilisaient des séquences d’ARNm comportant une coiffe ce qui permettait la fixation du ribosome à l’ARNm, mais la réaction permettant la fixation de la coiffe à l’ARNm était coûteuse et peu efficace. Ce constat a conduit les chercheurs à utiliser une séquence IRES (Internal Ribosome Entry Site) comme séquence initiatrice. Master I Biochimie App Module Biochimie et Biotechnologies Cours (SNV-Adrar) BOUZEKRI. A 19 Les séquences uploads/Industriel/ proteines-recombinantes.pdf