Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

SOMMAIRE INTRODUCTION 2- PRINCIPE DE BASE 3-METHODE ET APPAREILLAGE 4- ROTORS 5

SOMMAIRE INTRODUCTION 2- PRINCIPE DE BASE 3-METHODE ET APPAREILLAGE 4- ROTORS 5-APPLICATION A LA BIOCHIMIE 6-MANIPULATION ET ASPECT PRATIQUE 7-CALCUL INTRODUCTION Beaucoup d'expériences en biochimie exigent une ou plusieurs étapes de centrifugation. Cette technique permet d'exposer des échantillons à de fortes accélérations qui permettent la séparation des constituants. On peut ainsi fractionner une préparation en un sédiment (ou "culot"), constitué de matériel plus ou moins solidement entassé dans le fond du tube à centrifuger, et en un surnageant qui sera le liquide résiduel au dessus du sédiment. 1-PRINCIPES DE BASE Une particule soumise à un champ gravitationnel tend à se déplacer dans ce champ jusqu'à ce qu'elle rencontre une résistance capable de l'arrêter complètement. Ce principe fondamental de physique est très utilisé en biochimie pour séparer des précipités, des cellules, des organites et même des macromolécules. En mettant une préparation biochimique dans le rotor d'une centrifugeuse et en faisant tourner celui-ci, on génère une accélération qui va pousser les particules qui la composent vers l'extérieur du rotor, c'est-à-dire le fond du tube à centrifuger. La vitesse avec laquelle se déplaceront ces particules est proportionnelle à - la force gravitationnelle à laquelle la particule est soumise - la masse de la particule - la différence entre la densité de la particule et celle du solvant, et inversement proportionnelle à - la friction avec le milieu, en fonction de la taille et à la géométrie des particules. Une particule donnée (e.g. une sous-unité d'un ribosome) a donc une vitesse spécifique de sédimentation lors d'une centrifugation parce qu'elle a une combinaison donnée de masse, de densité et de morphologie. On exprime souvent cette caractéristique en coefficient de sédimentation, généralement exprimée en unités Svedberg (S). Plus une particule est massive ou dense ou ne génère qu'une faible friction (due à sa forme), plus son S sera élevé. Cette unité de "taille" est particulièrement employée pour caractériser les particules ribosomiques. C'est pourquoi on parle encore de ribosomes 70 S chez les procaryotes et 90 S chez les eucariotes. On peut facilement générer une force centrifuge en faisant tourner à haute vitesse un rotor pouvant contenir des tubes à centrifuger. Une force gravitationnelle se forme alors perpendiculairement à l'axe de rotation du rotor. 2-MÉTHODES ET APPAREILLAGE Centrifugeuses La principale limite qui détermine la vitesse de rotation du rotor est évidemment la force du moteur qui le fait tourner. Plus le rotor est lourd et volumineux, plus l'effort que doit fournir le moteur est grand. On a développé une gamme d'appareils en fonction des besoins expérimentaux, particulièrement au niveau des accélérations requises, des volumes de matériel à centrifuger, de la température de travail, etc. Centrifugeuses de table: Les modèles les plus simples, souvent appellées centrifueuses cliniques, permettent d'atteindre de faibles accélérations (1000 à 3000 xg) à des vitesses de rotation relativement basses (moins de 3000 RPM). Certains modèles sont réfrigérés, certains autres non. Centrifugeuses au sol: Ces appareils sont un peu plus complexes. Elles permettent d'obtenir des vitesses de rotation de l'ordre de 30 000 RPM, donnant pour les plus petits rotors des accélérations d'environ 20 000 xg. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces centrifugeuses permettent de centrifuger des relativement gros volumes. Certains rotors peuvent même contenir quatre ou six bouteilles de 250 mL. Ultracentrifugeuses: Ce sont des appareils complexes et coûteux qui permettent d'atteindre des accélérations très élevées (jusqu'à 300 000 xg) en faisant tourner des rotors très rapidement (50-85 000 RPM). De telles vitesses de rotation ne peuvent s'obtenir que sous pression très réduite. Les faibles pressions permettent aussi d'éviter la surchauffe du rotor et de l'échantillon. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces appareils doivent donc être munis de pompe à vide et de systèmes de réfrigération. Les volumes sont quelques peu limités, généralement on ne trouve pas de rotors pouvant contenir plus d'une dizaine de tubes de 40 mL. Récemment, la compagnie Beckman a fabriqué un modèle d'ultracentrifugeuse tournant à 130,000 rpm générant des accélérations de plus d'un million de g! Un diagramme et une description du fonctionnement d'une ultracentrifugeuse ont été publiés récemment (JM Perkel, 2004). Microcentrifugeuses: On a aussi développé des centrifugeuses spécialement conçues pour les micro- volumes très souvent employés en biochimie moderne. Les microtubes à centrifuger sont des petits tubes coniques généralement de 1.5 mL fait de polypropylène et assez peu dispendieux. Les centrifugeuses de ce type peuvent être réfrigérées et atteindre des accélérations de l'ordre de 12-15 000 x g. Les modèles les moins couteux n'ont pas de contrôle de vitesse et ne sont pas réfrigérés. Ultracentrifugeuses analytiques: Ce sont des appareils de moins en moins utilisés. Ces centrifugeuses servent surtout à analyser la taille et la masse des particules et des protéines. D'autres techniques beaucoup moins coûteuses sont utilisées de nos jours: électrophorèse, filtration sur gel... 3-Rotors La fabrication et la conception des rotors doivent tenir compte de nombreuses contraintes. Ils doivent être évidemment suffisamment résistants pour supporter les accélérations voulues mais suffisamment légers pour que le moteur de la centrfugeuse puisse les faire tourner à la vitesse requise. Pour les centrifugations à faible vitesse peuvent se faire avec des rotors en acier. Cependant, pour les fortes accélérations, on utilise des alliages à base de métaux à la fois légers et résistants comme l'aluminium et le titane. Les rotors faits de matériaux composites (à base de fibres de carbone), extrêmement résistants et légers, ont même fait leur apparition depuis quelques années. C'est pourquoi chaque rotor a une vitesse maximale à laquelle on peut les faire tourner. Il est esentiel de respecter scrupuleusement cette limite pour éviter le bris du rotor ou celui du moteur. Une autre contrainte est la dimension du rotor. Pour maximiser la vitesse de rotation il faut minimiser le rayon du rotor, donc sa taille. Pour centrifuger de gros volumes, il faut évidemment de plus gros rotors, ce qui explique que les rotors de grande capacité ne peuvent tourner qu'à des vitesses réduites. Il existe trois grands types de rotor: à angle fixe, à godets mobiles et verticaux. Les rotors à angle fixe ("fixed angle") sont faits de blocs de métal (aluminium, titane) avec des puits creusés à l'intérieur et inclinés avec un certain angle par rapport à l'horizontale, généralement de l'ordre de 15° à 35° selon les modèles. Les tubes à centrifuger sont déposés dans ces puits. Comme ces rotors sont relativement compacts. Ils sont plus faciles de les faire tourner rapidement à cause de leur rayon relativement court. Les particules sédimenteront surtout le long de la paroi du tube (voir figure suivante). De plus, elles s'accumulent plutôt sur des côtés du fond du tube à centrifuger. Pour certains types de particules cela engendre une friction qu'elles ne peuvent pas supporter et se brisent. Cependant, la plupart des centrifugations à vitesses moyennes et élevées se font avec ce type de rotor. Les rotors à godets mobiles ("swinging buckets") se réorientent lors de la centrifugation. En effet, les godets sont disposés sur des crochets ou un système à bascule. Quand la rotation du rotor débute les godets (et les tubes qu'ils contiennent), sous l'effet de la force centrifuge, se réorientent et passent en position horizontale. Les particules peuvent donc sédimenter directement dans le fond du tube sans jamais heurter les parois du tube (voir figure suivante). Elles s'accumulent dans le fond du tube à centrifuger. Le principal inconvénient de ce type de rotor est qu'il ne peut pas atteindre des vitesses très élevées comparé à l'autre. En effet, les godets en position horizontale allongent énormément le rayon du rotor, ce qui rend plus difficile de lui imprimer des vitesses de rotations élevées. Ce genre de rotor est utilisé principalement dans les centrifugation en gradients discontinus ou continus. Sédimentation des particules (cercle noir) dans divers types de rotor Migration d'une particule dans les deux principaux types de rotor. La plus grande partie du déplacement des particules dans un rotor à angle fixe se fait le long de la paroi distale du tube, ce qui n'est pas le cas dans le rotor à godets mobiles. La position du sédiment est aussi différente: bien centrée dans le fond du tube dans le rotor à godets mobiles, décalée vers le coté distal de la paroi du tube dans le rotor à godets mobiles. Les rotors verticaux sont beaucoup moins répandus et sont essentiellement utililisés pour les gradients de type isopicniques ou zonaux. Ils sont décrits plus en détail dans le chapitre du SIITUB sur la centrifugation en gradient de densité. Centrifugation en gradients On peut amplifier l'efficacité des méthodes de séparation en centrifugeant dans des gradients de densité. Ce type de méthode est décrit de façon plus détaillée dans un autre chapitre du SIITUB sur la centrifugation en gradient de densité. Ultracentrifugation analytique On peut déterminer avec une grande précision la masse et le coefficient de sédimentation des protéines et autres particules par ultracentrifugation analytique (UCA). Les méthodes à équilibre d'UCA permettent aussi de déterminer la masse. Cette technique exige un appareillage (centrifugeuse, rotor, etc.) spécialisé à cette fin. 4-APPLICATION À LA BIOCHIMIE Séparation de phases La séparation de uploads/Industriel/ tpe-centrifugation-gia.pdf