1 AIX-MARSEILLE UNIVERSITE FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE ECOLE DOCTORALE DES

1 AIX-MARSEILLE UNIVERSITE FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE THESE DE DOCTORAT Présentée et publiquement soutenue devant LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE Le lundi 2 juillet 2012, par Aurélie RENVOISÉ Née le 13 Décembre 1982 à La Seyne sur Mer Applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil d’identification et de détection bactérienne en laboratoire hospitalier de bactériologie. En vue d’obtention du grade de DOCTORAT d’AIX-MARSEILLE UNIVERSITÉ Spécialité: Maladies Infectieuses Composition du Jury: Pr Jean-Louis MEGE Président du Jury Pr Florence DOUCET-POPULAIRE Rapporteur Pr Guillaume ARLET Rapporteur Pr Vincent JARLIER Directeur de thèse Directeur du Laboratoire ER5 (UPRES EA 1541) « recherche expérimentale, épidémiologique et moléculaire sur la résistance aux antibiotiques » (Directeur : Pr Vincent Jarlier). Faculté de médecine Pitié-Salpêtrière, Université Pierre et Marie Curie (Paris VI). Cette structure est intégrée à l’IFR 113 « immunité – cancer - infection », Faculté de médecine Pitié-Salpêtrière (Directeurs : Pr Brigitte Autran et Pr David Klatzmann) 2 Avant propos: Le format de présentation de cette thèse correspond à une recommandation de la spécialité Maladies Infectieuses et Microbiologie, à l’intérieur du Master des Sciences de la Vie et de la Santé qui dépend de l’Ecole Doctorale des Sciences de la Vie de Marseille. Le candidat est amené à respecter des règles qui lui sont imposées et qui comportent un format de thèse utilisé dans le Nord de l’Europe et qui permet un meilleur rangement que les thèses traditionnelles. Par ailleurs, la partie introduction et bibliographie est remplacée par une revue envoyée dans un journal afin de permettre une évaluation extérieure de la qualité de la revue et de permettre à l’étudiant de commencer le plus tôt possible une bibliographie exhaustive sur le domaine de cette thèse. Par ailleurs, la thèse est présentée sur article publié, accepté ou soumis associé d’un bref commentaire donnant le sens général du travail. Cette forme de présentation a paru plus en adéquation avec les exigences de la compétition internationale et permet de se concentrer sur des travaux qui bénéficieront d’une diffusion internationale. Professeur Didier RAOULT 3 SOMMAIRE Résumé 5 Abstract 7 Abréviations 9 Introduction 10 Le ribosome bactérien 10 L’ARNr 16S : définition, origines et utilisation 12 Définition d’une espèce bactérienne 21 Place de la PCR universelle 16S dans l’identification bactérienne 24 Place de la PCR universelle 16S dans la détection de bactéries à partir de prélèvements 27 Objectifs du travail personnel 30 1 - Identification de souches de diagnostic phénotypique impossible ou difficile par PCR universelle 16S. Gordonia sputi bacteremia. Renvoise A, Harle J-R, Roux V, Raoult D. Commentaire 32 • Emerg Infect Dis. 2009 Sep;15(9):1535-7. Article 34 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Rebaudet S, Genot S, Renvoise A, Fournier P-E, Stein A. Commentaire 38 • Emerg Infect Dis. 2009 Jun;15(6):985-7. Article 40 2 - Détection bactérienne dans les prélèvements humains par PCR universelle 16S. Kytococcus schroeteri, a rare agent of endocarditis. Renvoise A, Roux V, Thuny F, Riberi A, Casalta JP. Commentaire 44 • Int J Infect Dis. 2008 Mar;12(2):223-7. Article 46 4 SOMMAIRE (suite) 3 - Description de nouvelles espèces pour des souches isolées de prélèvements biologiques humains grâce à la PCR universelle 16S. Actinomyces massiliensis sp. nov., isolated from a patient blood culture. Renvoise A, Roux V, Raoult D. Commentaire 52 • Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Mar;59(Pt 3):540-4. Article 53 Helcobacillus massiliensis gen. nov., sp. nov., a novel representative of the family Dermabacteraceae isolated from a patient with a cutaneous discharge. Renvoise A, Aldrovandi N, Raoult D, Roux V. Commentaire 59 • Int J Syst Evol Microbiol. 2009 Sep;59(Pt 9):2346-51. Article 60 Actinomyces timonensis sp. nov., isolated from a patient osteo-articular sample. Renvoise A, Roux V, Raoult D. Commentaire 67 • Int J Syst Evol Microbiol. 2010 Jul;60(Pt 7):1516-21. Article 69 Conclusions générales et perspectives Conclusions générales 75 Limites générales de la PCR universelle 16S 76 Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil d’identification bactérienne 77 Limites de la PCR universelle 16S en tant qu’outil de définition de nouvelles espèces bactériennes. Débats autour de la définition de nouvelles espèces. 81 Limites de la PCR universelle 16S comme outil de détection moléculaire à partir des prélèvements biologiques 83 Conclusion 87 Annexes Annexe 1 88 Annexe 2 90 Bibliographie 93 Remerciements 106 5 RESUME La PCR universelle ciblant le gène codant pour l’ARNr 16S à l’aide d’amorces universelles, a d’abord été développée pour des études phylogénétiques. En effet ce gène est universellement retrouvé chez les bactéries et sa fonction est conservée. Ainsi, il peut servir d’« horloge moléculaire » pour mesurer les distances phylogénétiques entre les différentes espèces bactériennes. La PCR universelle a ensuite été appliquée en microbiologie clinique dans deux domaines distincts : la détection et l’identification bactériennes. Dans ce travail, nous avons évalué l’applicabilité de la PCR « universelle » 16S comme outil diagnostique dans un centre hospitalier universitaire (hôpital la Timone, Marseille, France). Tout d’abord, nous avons décrit comment la PCR universelle permet l’identification de souches bactériennes mal identifiées par les techniques phénotypiques conventionnelles. Puis, nous avons montré que la PCR universelle peut être utilisée pour détecter l’ADN bactérien dans des prélèvements à culture négative, soit parce que le patient a reçu une antibiothérapie préalable, soit parce que le microorganisme responsable est de croissance difficile. Enfin, nous avons montré que la PCR 16S utilisée pour l’identification permet de mettre en évidence des souches susceptibles de représenter de nouvelles espèces et/ou de nouveaux genres bactériens. 6 Ainsi, la PCR universelle est applicable dans un laboratoire de bactériologie de routine dans les trois objectifs ci-dessus. Elle permet une identification précise des souches bactériennes et l’amélioration du diagnostic des infections associées à des cultures négatives et, par là-même, l’amélioration de la prise en charge des patients. La PCR universelle permet aussi d’étendre nos connaissances des maladies infectieuses et de la phylogénie bactérienne. Bien que la PCR universelle présente certaines limites (discutées dans ce travail), elle reste aujourd’hui le gold- standard incontournable de l’identification et de la détection moléculaires dans les laboratoires de bactériologie. Mots clés: PCR universelle, 16S rRNA gene, diagnostic moléculaire, identification, détection, taxonomie, nouvelles espèces 7 ABSTRACT Broad-range 16S rDNA PCR using universal primers was first developed for phylogenetic purpose since 16S rRNA gene is found in every bacterial species with a conserved function; consequently 16S rRNA gene can be used as a molecular clock for assessing bacterial phylogeny. Broad-range PCR was then applied to medical microbiological diagnosis in two distinct fields: molecular detection and bacteria identification. In the present work, we evaluated the applicability of broad-range PCR as a diagnostic tool in a teaching hospital (Timone Hospital, Marseilles, France). First, we showed that broad-range PCR allows identification of bacteria obtained in culture but misidentified by conventional phenotypic methods. Second, we showed that universal PCR permits bacterial detection in culture- negative infection. Third, we exemplified that using broad-range PCR is a valuable tool to identify new bacterial species and/or genera. Consequently, universal PCR is applicable in routine laboratories in the three above fields; it allows a more accurate identification of bacterial strains and permits to diagnose culture-negative bacterial infections, thus improving patient’s management. It also improves our knowledge of infectious diseases together with bacterial diversity and phylogeny. Although universal PCR 8 presents certain limitations (discussed in this work), it remains today the gold- standard for molecular identification and detection in routine laboratories. Keywords: broad-range PCR, 16S rRNA gene, molecular diagnosis, identification, detection, taxonomy, new species. 9 ABREVIATIONS ADN…………………… acide désoxyribonucléique ARN………………… acide ribonucléique ARNr ou rRNA……… acide ribonucléique ribosomique ARNr 16S ou 16S rRNA constituant ARN de la petite sous-unité ribosomale du 30S des procaryotes 16S rRNA gene ……… le gène codant les ARN ribosomaux 16S PCR ………………… réaction en chaîne par polymérase (de l'anglais polymerase chain reaction) rpoB ………………… gène codant pour la sous-unité béta de l'ARN maldi-tof ……………… matrix-assisted laser desorption ionization-time-of- flight S……………………… Le Svedberg, de symbole S, est une unité de mesure du taux de sédimentation. 10 INTRODUCTION 1. Le ribosome bactérien Le ribosome est un complexe ribonucléoprotéique (c’est-à-dire composé de protéines et d’ARN) ; il permet la synthèse des protéines en utilisant l’ARN messager comme source d’information et les ARN de transfert associés aux acides aminés comme substrats. Cette synthèse protéique, encore appelée traduction est divisée en cinq phases principales : la liaison de l'ARN messager au ribosome, l'initiation, l'élongation, la terminaison et le recyclage des sous unités ribosomales. Chez les bactéries, le ribosome est composé d’une grande sous-unité (50S) et d’une petite sous-unité (30S) (cf Figure 1 page 10). Figure 1 : L’ARN ribosomique 16S : un constituant de la petite sous-unité ribosomale des procaryotes. 11 Au total, le ribosome fonctionnel (composé des deux sous-unités réunies) a une masse moléculaire de 2,5-megadalton et un coefficient de sédimentation de 70S (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). La petite sous-unité est composée de l’ARN ribosomal 16S (cf Figure 1 page 10) (codé par un gène d’environ 1500 nucléotides) et d’environ 20 protéines ; elle permet la « lecture de l’ARN messager ». La uploads/Litterature/ renvoise-2593035580k-th-pdf.pdf

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littérature  universelle bactérienne espèces microbiol.
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