1 Abdelaziz SOUKRI ME Plus FROMAGERIE FROMAGERIE DES DOUKKALA DOUKKALA DÉNOMBRE
1 Abdelaziz SOUKRI ME Plus FROMAGERIE FROMAGERIE DES DOUKKALA DOUKKALA DÉNOMBREMENT DES ANAEROBIES SULFITO REDUCTEURS DES ANAEROBIES SULFITO REDUCTEURS A 46°C A. SOUKRI 27/06/2009 I‐ DEFINITION I DEFINITION 2 Ce sont des bactéries qui cultivent en anaérobiose en réduisant les sulfites (SO32‐) en sulfures (S2‐) à 46°C. 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus I‐ DEFINITION I DEFINITION 3 Les Clostridium : ce sont des bacilles Gram +, anaérobies stricts sporulés cultivant à 37°C stricts, sporulés, cultivant à 37 C. Les Clostridium sulfito‐réducteurs : ce sont des bactéries commensales de l’intestin. la présence de bactéries ou de spores traduit une contamination fécale qui peut être ancienne car les spores résistent longtemps à l’ té i d l’extérieur du corps. 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus I‐ DEFINITION I DEFINITION 4 Clostridium perfringens: est un Clostridium sulfito‐réducteur lti t à 6°C cultivant à 46°C. Rechercher car il est parfois responsable d’intoxications alimentaires, notamment dans les conserves où il peut proliférer puisque les spores résistent à la stérilisation par proliférer puisque les spores résistent à la stérilisation par chauffage. 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus II‐ TECHNIQUE II TECHNIQUE 5 Dénombrement des anaérobies sulfito‐réducteurs à 46°C sulfito réducteurs à 46 C Lecture et identification Dénombrement des spores de Clostridium sulfito‐réducteurs 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus II‐ TECHNIQUE II TECHNIQUE 6 1‐ Dénombrement des anaérobies sulfito‐réducteurs à 46°C Milieux utilisés : Milieu TSN : Tryptone ‐ Sulfite ‐ Néomycine yp y Milieu TSC : Tryptone ‐ Sulfite ‐ Cyclosérine Technique d’ensemencement en tubes: analyse effectuée sur 1mL d’inoculum (produit pur ou dilutions) dans y (p p ) le milieu en surfusion. mélanger sans faire de bulles et solidifier sous l’eau froide. recouvrir de paraffine solide ou incuber en jarres anaérobies Incubation 24 à 48h à 46°C. 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus II‐ TECHNIQUE II TECHNIQUE 7 Technique d’ensemencement en boites: Technique d ensemencement en boites: analyse effectuée sur 1mL d’inoculum (produit pur ou dilutions) ensemencé dans la masse en double couche dilutions) ensemencé dans la masse en double couche Incuber en jarres anaérobies Incubation 24 à 48h à 46°C Incubation 24 à 48h à 46°C 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus II‐ TECHNIQUE II TECHNIQUE 8 2. Lecture et identification Après incubation, les colonies de bactéries anaérobies sulfito réductrices sont noires. Ces colonies sont alors suspectes d’être Clostridium perfringens Clostridium perfringens. On effectue ensuite l’identification de Clostridium perfringens : On effectue ensuite l identification de Clostridium perfringens : En milieu MMN : mobilité ‐, NR+ En milieu lactosé au rouge de phénol et à la gélatine : lactose +, gélatinase + g 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus II‐ TECHNIQUE II TECHNIQUE 3 Dénombrement des spores de Clostridium sulfito réducteurs 9 3. Dénombrement des spores de Clostridium sulfito‐réducteurs Milieux utilisés : Milieu TSC sans Cyclosérine l ( lf d ) Milieu VFSR (VF Sulfito‐réducteurs) Technique d’ensemencement Pour dénombrer les seules spores de Clostridium sulfito‐réducteurs, il faut d’abord détruire les formes végétatives : Pl l l é i d i è d t b té il i à 8 °C Placer le volume nécessaire de suspension mère dans un tube stérile 10 min à 80°C (bain marie) Ajouter du milieu TSC sans cyclosérine ou VFSR j y Mélanger sans faire de bulles et solidifier sous l’eau froide Recouvrir de paraffine solide ou incuber en jarres anaérobies p j Incubation 24 à 48h à 37°C 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus II‐ TECHNIQUE II TECHNIQUE Aj t d ili TSC l é i VFSR 0 Ajouter du milieu TSC sans cyclosérine ou VFSR Mélanger sans faire de bulles et solidifier sous l’eau froide Recouvrir de paraffine solide ou incuber en jarres anaérobies Recouvrir de paraffine solide ou incuber en jarres anaérobies Incubation 24 à 48h à 37°C Lecture et identification: h l i i t i d’ d’ ù l dét i ti chaque colonie noire est issue d’une spore d’où la détermination du nombre de spores dans le produit. Rq: Les spores de Clostridium perfringens sont recherchées i ll d l’ essentiellement dans l’eau Il est aussi possible de mettre en évidence les spores par la coloration au vert de malachite au vert de malachite 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus III‐ EFFET CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE 11 Clostridium tyrobutyricum l'agent principal du gonflement tardif des fromages de type l agent principal du gonflement tardif des fromages de type Emmental quelques centaines de spores par litre de lait suffisent pour faire apparaître des défauts pour faire apparaître des défauts. (Gouet et Bergère, 1973) 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus III‐ EFFET CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE 12 Actuellement, Le contrôle de la teneur des laits en spores de « butyriques » p y q s'effectue par la méthode préconisée par l'Institut Technique du Gruyère (LT.G.) sur le milieu de Bryant Burkey modifié par Bergère, par la technique du nombre le plus probable (Bergère et coll., 1972) M i Mais, cette méthode est lente (5 à 7 jours), peu sensible et peu précise, dans les conditions courantes d'utilisation; elle n'est, de plus, pas spécifique de C. tyrobutyricum. 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus IV‐ RESULTATS ET DISCUSSION IV RESULTATS ET DISCUSSION Mi i d RCM difié 13 13 Mise au point du RCM modifié Ch i d ili d b Choix du milieu de base Le milieu de Bryant Burkey modifié par Bergère n'a pas été b d ili h hé ff ili retenu comme base du milieu recherché ; en effet, sur ce milieu C.tyrobutyricum ne se développe que lentement, son temps de é é ti ét t d l' d d h à h (B è 8 ) génération étant de l'ordre de 1 h 15 à 1 h 45.(Bergère, 1983) Le milieu RCM (Hirsch et Grinsted, 1954), qui permet une croissance rapide de tous les Clostridium, a été choisi, la nécessaire sélectivité étant recherchée dans l'addition d'antibiotiques. 27/06/2009 A.SOUKRI 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus EFFET CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE ll SUR LE FROMAGE 4 Pour pallier en partie ces inconvénients concentrer les spores par filtration du lait dénombrer les colonies obtenues sur le filtre, appliqué sur un milieu gélosé sélectif, après un temps d'incubation ffi suffisant. L'objet de ce travail était précisément la mise au point du milieu gélosé nécessaire. (Bourgeois et coll., 1984) 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus EFFET CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE SUR LE FROMAGE 15 Les suspensions de spores ont été filtrées sous vide sur b d ll l ( ll ) membranes en esters de cellulose (Millipore AAWP 04700). Les membranes ont été déposées sur le milieu et incubées 48 h à 37° C en jarre anaérobie (système Anaérocult A ‐ Merck). Après incubation, le développement des germes tests en é d t él tif été é présence des agents sélectifs a été comparé, par dénombrement des colonies obtenues sur la membrane, à un témoin réalisé sur le milieu de base (ReM sans agent sélectif) témoin réalisé sur le milieu de base (ReM sans agent sélectif). 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus EFFET CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE Filt ti i d l it SUR LE FROMAGE 6 Filtration sous pression du lait Elle s'effectue conformément au protocole suivant: Elle s effectue conformément au protocole suivant: Lait cru (V ml) (Bourgeois et coll., 1984) Lait cru (V ml) Traitement thermique 75°C ‐ 15 min Refroidissement Addition de Triton X‐lOOà 1% en eau distillée (V ml) (1) Trypsine à 1 % en tampon Tris HCI 0,1M à pH 7,8 (V/4 ml) (2) Homogénéisation au Stomacher pendant 1 min Homogénéisation au Stomacher pendant 1 min Incubation 55°C ‐ 15 min Filtration à 3 bars sur membrane 0,8 micromètre 3 , Rinçage de la membrane à l'eau distillée stérile à 55°C 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus III‐ EFFET CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE Défi iti t é ti d ili R M difié TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE 17 Définition et préparation du milieu ReM modifié Le milieu de base est le RCM Agar (Merck) auquel on ajoute de la fuchsine Le milieu de base est le RCM Agar (Merck) auquel on ajoute de la fuchsine acide (l g/I). Le milieu est stérilisé à 121°C pendant 15 min. Au moment de l'emploi, on ajoute dans le milieu en surfusion (45C°) une solution de cyclosérine (dissoute en eau distillée et stérilisée par une solution de cyclosérine (dissoute en eau distillée et stérilisée par filtration) Le milieu complet est coulé en boîtes de Pétri (diamètre 55 mm),et séché avant emploi sous hotte à flux laminaire ou en étuve à 370 C. 27/06/2009 Abdelaziz SOUKRI ME Plus III‐ EFFET CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE d l d d f TYROBUTYRICUM SUR LE FROMAGE 8 Recouvrement des Clostridum sp sur RCM modifié Cet essai a été réalisé sur des suspensions en eau distillée de spores Cet essai a été réalisé sur des suspensions en eau distillée de spores des germes‐tests suivants : C. tyrobutyricum (6 souches), C. sporogenes, C. bifermentans, uploads/Litterature/1-denombrement-bacteries-sulfo-reducteur-ct.pdf
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- Publié le Nov 01, 2022
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