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TP SV42 Génie-génétique Introduction : Le but de ce TP est de cloner le fragmen

TP SV42 Génie-génétique Introduction : Le but de ce TP est de cloner le fragment d’ADN humain de la béta-actine une protéine qui combiné à la myosine sert à la contraction musculaire. Pour cela nous allons insérer le fragment d’ADN dans le plasmide PUC19 et le mettre dans la bactérie E.coli afin qu’elle réplique le plasmide indépendamment de son propre génome, ensuite nous allons étudier les clones du plasmide des bactéries recombinées. Premièrement, nous allons faire une digestion enzymatique du plasmide ainsi qu’une déphosphorylation afin de préparer le plasmide à se lier au fragment d’ADN. Puis nous allons faire une ligature pour lier le fragment d’ADN avec le plasmide, ensuite, nous allons faire une transformation bactérienne afin de rendre la bactérie E.coli compétente (qui est capable d’accepter le plasmide et de le répliquer), E.coli va ensuite cloner le fragment d’ADN. Nous allons étudier les clones des bactéries recombinées avec le fragment d’ADN de béta-actine en utilisant la méthode de la PCR et celle de la digestion enzymatique de l’ADN plasmidique purifié. Etapes du clonage : - La digestion enzymatique : Le but de cette étape est de linéariser le plasmide avec l’enzyme de restriction EcoRI (G/AATTC), pour cela on incube à 37°C une solution de plasmide PUC19 avec l’enzyme de restriction EcoRI une solution tampon et de l’eau. Une fois la digestion enzymatique terminé, il faut neutraliser EcoRI pour qu’elle ne gène pas la suite des manipulations en mettant la solution à une température de 80°C pendant 5 minutes. A la fin de la manipulation, la solution ne devrait contenir que des plasmides linéaires de 2686 paires de bases, pour vérifier ça on peut faire un gel d’agarose pour déterminer le poids des fragments d’ADN présents dans la solution. En théorie on devrait avoir ce résultat : Ici PM correspond au marqueur de poids de référence Le trait à côte correspond à la migration des fragments d’ADN de la solution. - La déphosphorylation : Le but de cette étape est d’empêcher le plasmide de retrouver une forme circulaire en enlevant un phosphate sur l’extrémité 5’. Pour cela, on ajoute de la phosphatase dans le milieu réactionnel et on incube à 37°C, puis on inactive la phosphatase avec un choc thermique à 75°C. On conserve le milieu réactionnel dans la glace. Après la déphosphorylation il ne devrait y avoir dans la solution que des fragments d’ADN linéaire de 2686 pb et aucun fragment circulaire. Si on refait un gel d’agarose, le résultat devrai être le même qu’avant la manipulation - La ligature : Le but de la ligature est de lier le fragment d’ADN de la béta-actine au plasmide PUC19, dans l’expérience, nous allons faire 3 ligatures différentes, une avec l’insert le vecteur et la ligase (R), une avec le vecteur et la ligase (B) et une avec seulement le vecteur (C). Théoriquement le tube R ne contiendra que des fragments d’ADN circulaire de 3038 pb. Le tube B ne contiendra que des fragments d’ADN circulaire de 2686 pb et le tube C contiendra des fragments d’ADN linéaire de 2686 pb. Avec une électrophorèse sur gel d’agarose, on devrait avoir les résultats suivants : - La transformation bactérienne : Le but de la transformation bactérienne est de rendre E.coli compétente afin qu’elle puisse dupliquer le plasmide. Dans l’expérience nous allons faire 4 transformations, une avec les plasmides modifiés (la réaction R) une avec le témoin B, une autre avec le témoin C et un autre témoin de de la transformation bactérienne (la réaction D). La méthode utilisée est le choc thermique qui rend la bactérie compétente en créant des pores dans la membrane de la bactérie avec une différence de pression crée par la hausse de température. Les bactéries sont ensuite placées sur une boite de culture contenant des antibiotiques qui peuvent être neutralisé par un fragment d’ADN contenue dans le plasmide PUC19. Théoriquement seules les bactéries du tube R et B pourront se développer dans le milieu de culture car ce sont les seules bactéries qui ont la capacité de résister à l’antibiotique. - L’étalement des produits de transformation : On étale les produits de transformation afin de pouvoir sélectionner les fragments à cloner parmi les bactéries qui sont capable de résister à l’antibiotique. Pour cela on utilise la technique du crible blanc bleu pour ensuite étaler les bactéries dans les milieux de culture. Cette technique consiste à placer une petite partie du gène lacZ sur le vecteur car celui-ci est codant pour la β-galactosidase. Cette enzyme transforme le X-galactose en un produit bleu qui va s’accumuler dans les cellules quand elle La migration du tube C est plus importante que celle du tube B alors que les fragments d’ADN sont censés avoir le même nombre de paire de base car les fragments du tube B sont circulaires et ceux du tube C sont linéaires, Les fragments du tube B migrent donc moins. est exposée à l’IPTG. Et si le gène est interrompu par un fragment d’ADN, alors il ne sera plus fonctionnel et donc les colonies avec ce vecteur seront blanches. On a donc R qui devrait avoir plusieurs colonies blanches car les inserts devraient s’être insérer sur ceci, mais les colonies bleues seront sûrement la majorité. Sur B on devrait avoir des colonies bleues car l’insert n’est pas présent et lacZ est donc fonctionnel, mais l’ampicilline ferait qu’aucune colonie ne se seraient développé car elles ne sont pas résistantes. Sur C on devrait avoir uniquement des colonies blanches car lacZ n’est plus fonctionnel, mais aucune colonie ne se développera car les bactéries n’ont pas été rendu résistante à l’ampicilline. Sur D, les colonies devraient être bleus car lacZ est fonctionnel, mais il n’y aura aucune colonie car les bactéries ne sont pas résistantes à l’ampicilline. - La PCR : La PCR est utilisée pour répliquer les fragments d’ADN avec différents cycles se divisant en cycle de dénaturation, cycle d’hybridation, et cycle d’élongation. On aura à terme le morceau d’ADN voulu qui aurait été répliqué un grand nombre de fois. Pour mesurer sa taille, on pratique une électrophorèse sur gel d’agarose, où les morceaux d’ADN se déplaceront plus rapidement vers le pôle positif s’ils sont plus petit. On peut ainsi établir la taille des fragments prélevé. Normalement, on devrait le plasmide de la bactérie bleu qui aurait migré plus loin que le plasmide de la bactérie blanche, car sans l’insert qui a été intégré au plasmide de la bactérie blanche, il est plus petit et plus léger. On voit ici que R1 (bactérie bleu) a migré plus loin que R2 ( bactérie blanche) car R1 ne comporte pas d’insert et est donc plus petit - - - La préparation de l’ADN plasmidique : La préparation de l’ADN plasmidique consiste à le purifier afin de pouvoir l’analyser et qu’il soit digérer sans obstacle, pour cela on a d’abord la culture des bactéries qui est faite avec de l’ampicilline, pour que ce soit uniquement les plasmides recombinés qui soit présent, on pratique ensuit la lyse sur les bactéries pour qu’il ne reste plus que l’ADN génomique, les ribosomes et les protéines. On sépare ensuite l’ADN génomique en centrifugeant le tout est en prélevant le surnageant, où se trouve les plasmides, les protéines et les ribosomes. On effectue ensuite un lavage sur colonne avec une solution salé pour évacuer les protéines et les ribosomes, et prélève ensuite les plasmides avec une solution peu salé. On s’attend ainsi à avoir uniquement des plasmides recombinés présent dans la solution finale. - La digestion enzymatique des ADN plasmidique : La digestion enzymatique des ADN plasmidique à pour but de vérifier si notre ADN plasmidique a bien été recombiné. Pour cela, l’ADN plasmidique est digéré par l’enzyme EcoR1. On a donc deux échantillons par clone : L’ADN digéré et l’ADN non digéré. On s’attend à ce que pour l’échantillon R1 (bactérie bleu), les deux échantillons soit à peu près au même niveau sur le gel d’agarose, car l’endroit qui à était coupé n’avait pas l’insert, il n’y a donc pas eu de perte de bases. On s’attend par contre à ce que pour R2 bactérie blanche) l’échantillon d’ADN digéré ait migré plus loin que l’échantillon d’ADN non digéré, car la coupe a eu lieu autour de l’insert, donc on a une perte de bases avec la perte de l’insert lors de la digestion. uploads/Management/ attendus-tp.pdf