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UNIVERSITE VICTOR SEGALEN BORDEAUX II U.F.R DES SCIENCES DE LA VIE DEPARTEMENT

UNIVERSITE VICTOR SEGALEN BORDEAUX II U.F.R DES SCIENCES DE LA VIE DEPARTEMENT SCIENCE, TECHNOLOGIES, SANTE 146 RUE LEO SAIGNAT 33076 BORDEAUX CEDEX LICENCE SCIENCE DE LA VIE ET DE LA SANTE RAPPORT DE STAGE Présenté par Prongsagorn SANVITTAYAGUL Sujet : Rôle de l’AICAR et l’interaction entre AICAR et l’autre facteur de transcription chez Saccharomyces cerevisiae Lieu de stage : Institut de Biochimie et Génétique Cellulaire CNRS UMR 5095 1, rue Camille Saint Saëns 33077 Bordeaux cedex Maître de stage : Bertrand Daignan-Fornier Durée de stage : un mois et demi 1 REMERCIEMENTS Je tiens tout d’abord à remercier Bertrand Daignan-Fornier, mon maître de stage, pour ses aides, ses conseils pertinents, sa confiance, de m’avoir motivé à poursuivre mes manipulations et mes travaux quand je n’ai pas eu de la chance pour mes résultats ainsi que pour son support lors des moments difficiles. Je voudrais également dire « merci » très fort à toute l’équipe du GRM pour le chaleureux accueil, pour sa bonne humeur, et pour ses conseils sur les démarches de manipulation à effectuer durant le stage. 2 SOMMAIRE I. INTRODUCTION :.............................................................................................................................................3 II. RESUME………….............................................................................................................................................3 III. PRESENTATION DE L’ETUDE……..………………………………………………………………..…...4 A. Biosynthèse des nucléotides puriques........................................................................................................5 - 1. voie de novo………....................................................................................................5 - 2. voie de recyclage ………………………………………….......................................6 IV. RESULTATS :……………….……………………………………………………………………..…...……6 - Partie I : La fonction de SAICAR sur les facteurs de transcription Bas1p et Bas2p….6 - Partie II : A la recherche un ou des gène permettant à utiliser mieux AICAR…….. 10 V. DISSCUSION…………………………………………………………………………….11 - Partie I : La fonction de SAICAR sur les facteurs de transcription Bas1p et Bas2p...11 - Partie II : A la recherche un ou des gène permettant à utiliser mieux AICAR……...12 VI. MATERIEL ET METHODE………………………………………………………..…13 - I. Plasmide et souche de levure……………………………………………………..13 A. Souche de levure…………………………………………………………...13 B. Plasmide……………………………………………………………………13 - II. Manipulation d’E. coli...........................................................................................14 - III. Manipulation de S.cerevisae…………………………………………………….14 A. Milieux de cultures………………………………………………………...14 B. Transformation de S.cerevisae…………………………………………....14 - IV. PCR mutagenèse et «GAP repair » ……………………………………………15 VII.BIBLIOGRAPHIE……………………………………………………………………...15 3 I. INTRODUCTION Ce rapport a pour objectif de conclure la totalité de mon stage de Licence Science de la vie, qui s'est déroulé à l’Institut de Biochimie et Génétique Cellulaire (IBGC). Ce stage a été prolongé, et a duré un mois et demi au lieu de un mois. Le but de ce stage a été de compléter le travail réalisé jusqu’à l’heure actuelle. Mon travail a été de revisiter une partie de la voie de biosynthèse d’AMP dans de l’utilisation d’AICAR et de SAICAR, deux intermédiaires qui sont synthétisés par cette voie et qui jouent plusieurs rôles importants dans la régulation de la voie de biosynthèse de l’AMP. Les stratégies utilisées ici, consiste à utiliser plusieurs mutants en les transformant avec les plasmides d’intérêt suivit par des cribles génétiques sur les milieux de sélections. II. RESUME : Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l’expression des gènes de biosynthèse de l’AMP (gène ADE) est transcriptionnellement réprimée par l’adénine extracellulaire et activé par les facteurs de transcription Bas1p et Bas2p. L’activation de l’expression des gènes ADE nécessite la présence d’un intermédiaire métabolique de la voie de biosynthèse de l’AMP : le 5’-phosphoribosyl 4-succinocarboxamide 5-aminoimidazole (SAICAR). Le SAICAR module in vivo l’interaction entre les protéines Bas1p et Bas2p et joue aussi le rôle de signal pour l’interaction de la protéine Bas2p. Le 5’-phosphoribosyl 4-carboamide 5-aminoimidazole (AICAR), un autre intermédiaire de la voie de biosynthèse de l’AMP, peut également activer l’expression de gène ADE. Il joue donc aussi un rôle important dans la régulation de cette voie. Le facteur de transcription Bas1p est déjà normalement fixé sur l’opérateur du gène ADE (ici ADE17). C’est elle qui va recruter le facteur de transcription Bas2p au moment approprié, c’est-à-dire quand les deux molécules intermédias (SAICAR et AICAR) sont présentes au bon endroit et au bon moment. J’ai essayé de mettre en évidence la région de fixation de l’AICAR sur la protéine Bas2p en utilisant un mutant ade1∆ et en créant un nouveau transformant avec un plasmide qui porte le gène muté synthétisant la protéine Bas2p qui va se fixer sur CAIR au lieu d’ AICAR. J’ai ensuite essayé de trouver un nouveau gène qui permettra au mutant une meilleure utilisation d’AICAR. 4 III. PRESENTATION DE L’ETUDE Figure 1 : Schéma de la voie de biosynthèse des nucléotides puriques chez la levure, des co-substrats et des gènes impliqués ADE4,… : nom des gènes PRPP,… : nom des intermédiaires 5 A. Biosynthèse des nucléotides puriques Les nucléotides puriques sont synthétisés sous forme mono phosphate (AMP et GMP), et ceci, par deux voies de biosynthèse. D’une part, la cellule peut utiliser les nucléotides et les bases puriques déjà formés et les transformer en nucléotides par la voie de recyclage. D’autre part, elle peut synthétiser ces nucléotides à partir du phosphoribosyl-pyrophosphate (PRPP) via la voie de novo. (Voir figure 1) Ces deux voies de biosynthèse existent chez la plupart des organismes à l’exception des parasites qui ne possède pas d’équipement enzymatique nécessaire pour la voie de novo. Ils peuvent uniquement utiliser la voie de recyclage et sont donc dépendants de leur organisme hôte, qui leur fournit les précurseurs nécessaires pour la synthèse des nucléotides puriques dont ils ont besoin. Lors du fonctionnement normal d’une cellule, la voie de recyclage semble être suffisante pour assurer l’essentiel des besoins en nucléotides puriques. Par contre, lors de la division cellulaire, elle doit doubler son pool de nucléotides et la voie de novo devient alors nécessaire. Dans des fibroblastes en culture, il a ainsi été montré que la biosynthèse de novo des nucléotides puriques augmente lorsque les cellules entrent en phase G1, ce qui suggère que cette voie est important lorsque les cellules sont en prolifération. 1. voie de novo : (voir figure 1) La biosynthèse de novo des nucléotides puriques consiste en une succession de dix étapes enzymatiques permettant la transformation du phosphoribosyl- pyrophosphate (PRPP) en inosine 5’-monophosphate (IMP). L’IMP sera ensuite transformé soit en AMP, soit en GMP par deux étapes enzymatiques supplémentaires (Voir la figure 1). La particularité de cette voie de biosynthèse est que les deux cycles de noyau purique sont formé directement sur le ribose 5-phosphate du PRPP, contrairement à la biosynthèse des nucléotides pyrimidiques où il y a d’abord la formation de base azotée, puis l’addition du ribose 5-phosphate. Cette voie de biosynthèse est coûteuse, puisque la formation d’une molécule d’IMP va nécessiter, en plus du PRPP, deux molécules de glutamine, deux molécules de 10-formyltétrahydrofolate (THF), une molécule d’aspartate, quatre molécules d’ATP, qui sont hydrolysées en ADP et phosphate, en une molécule de dioxyde de carbone Les dix étapes de la biosynthèse de novo des nucléotides puriques ainsi que les enzymes qui les catalysent sont très conservées entre les différents organismes. Certains organismes présentent néanmoins quelques particularités. Chez certaines bactéries, par exemple chez Escherichia coli, la conversion de l’AIR en CAIR se déroule en deux étapes, avec formation d’un intermédiaire supplémentaire : le N5- CAIR, alors que chez d’autres organismes, cette réaction se fait en une seule étape. Une autre particularité de cette voie de biosynthèse chez E.coli est l’existence d’une 6 GAR transformylase supplémentaire capable d’utiliser le formate dans des conditions de carence en 10-formyl tétrahydrofolate, le substrat habituel de GAR transformylase. 2. Voie de recyclage : (voir figure 1) Cette voie permet à la cellule d’utiliser les précurseurs purique, bases ou nucléosides, provenant de la dégradation des acides nucléiques ou présents dans le milieu extracellulaire. Un grand nombre d’activités enzymatiques existent dans les organismes. Sur la figure 1 sont représentées les activités enzymatiques permettant la transformation des bases puriques en nucléotides chez la levure, où seules les bases peuvent entrer dans la cellule. IV. RESULTATS Partie I La fonction de l’AICAR sur les facteurs de transcription Bas1p et Bas2p Les gènes BAS1 et BAS2 ont été isolés et ont été caractérisés comme régulateur du niveau de transcription du gène HIS4 et par ailleurs, il a été montré que l’expression de tous les gènes de biosynthèse de l’IMP, à l’exception du gène ADE16, est activée par les facteurs de transcription Bas1p et Bas2p et réprimé par l’adénine extracellulaire. Au niveau moléculaire, SAICAR et AICAR sont connus comme les activateurs de l'expression de gène d'ADE en favorisant l'interaction entre Bas1p et Bas2p, deux facteurs de transcription nécessaires pour l'expression des gènes ADE. Bas2p va aller se fixer sur Bas1p au moment où elle réagit avec AICAR et l’ensemble du complexe pourra activer la transcription du gène ADE (ici ADE17). Or, comme nous ne savons pas encore comment AICAR réagit sur Bas2p, j’ai donc entrepris, pour élucider cette question, de caractériser la zone de fixation de l’AICAR sur Bas2p afin de confirmer cette fixation et de trouver la séquence de la zone de fixation. Pour cela la stratégie est basée sur l’hypothèse suivant: Si Bas2p se fixe sur l’AICAR donc un mutant Bas2p qui fixe CAIR à la place d’AICAR va être capable aussi d’activer la transcription du gène ADE 17 chez le mutant ade1 qui ne produit pas d’AICAR mais qui accumule le CAIR Le principe de l’ensemble des stratégies et des techniques utilisées ici est de trouver uploads/Management/ rapport-de-stage - 2022-12-26T220808.890.pdf