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1 Thèse de doctorat Biologie cellulaire et moléculaire spécialité biotechnologi

1 Thèse de doctorat Biologie cellulaire et moléculaire spécialité biotechnologies végétales présentée à L’Université de Picardie Jules Verne par Guillaume LEBAS Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de Picardie Jules Verne Soutenue le 28/09/2012, après avis des rapporteurs, devant le jury d’examen : M. B. Hirel, Directeur de Recherches Rapporteur M. J. Le Gouis, Directeur de Recherches Rapporteur M. G. Decocq, Professeur Examinateur Mme. M. Brancourt, Chargée de Recherches Co-directrice de thèse M. F. Dubois, Professeur Directeur de thèse Etude du métabolisme carboné et azoté de Miscanthus x giganteus 2 REMERCIEMENTS Dans un premier temps je souhaite remercier les membres du jury d’avoir accepté de participer à celui-ci, et en particulier Bertrand Hirel et Jacques Le Gouis pour y tenir le rôle de rapporteur de mon manuscrit ainsi que Guillaume Decocq pour son rôle d’examinateur. Je remercie également la région Picardie pour son financement du projet MISCAZOTE dans lequel s’inscrit ma thèse et le FEDER pour le financement de la thèse. Je tiens à remercier Frédéric pour son encadrement tout au long de ces quatre années de thèse et notamment durant la rédaction épineuse de ce manuscrit, sans jamais perdre son sens de l’humour ni sa patience. Je pense qu’il me faudra encore méditer quelques années afin de maitriser entièrement ton précepte « du-donc-auquel » qui, il faut le dire, reste encore obscur pour certains initiés bien plus sages que moi. Un grand merci à Maryse, notamment pour ses encouragements et les corrections lors de la dernière ligne droite de cette rédaction. Je voudrai remercier également les autres membres de l’équipe AEB avec qui j’ai eu la chance de travailler quotidiennement. Manuella, qui m’a accueilli dans son bureau durant deux années et m’a beaucoup aidé pour les analyses IRMS et les enseignements. Anthony, pour les nombreuses heures passées en tête à tête avec le broyeur à billes à ma place. Thomas, pour les longues discussions, et ses recommandations pour la thèse et l’après. David, Jérôme, Thierry, M. et Mme Sangwan pour leurs mots d’encouragement, et Vivien, Benjamin, Gérard et N’Diaga pour les moments passés à « tchopèrer » devant le hall entre deux manips. Je n’oublie pas les stagiaires qui ont contribué à la réalisation de ce projet : Arthur, Romain, Baptiste, Matthieu et Cindy. Certains continuant dans cette voix, j’aime à croire que je n’ai pas dû être un si mauvais maître de stage… Je tiens également à remercier l’ensemble des personnes avec qui j’ai collaboré sur le projet MISCAZOTE aussi bien lors la mise en place des expérimentations que lors des prélèvements aux champs ou des parties de baby-foot durant la pause du midi à Estrées-Mons. Je n’oublie pas Jean-Xavier, ancien thésard de l’équipe, avec qui j’ai collaboré sur les analyses par RMN. Karine et Sophie, elles aussi ex-membres de l’équipe, avec qui j’ai toujours pu discuter recherche et de milliers d’autres choses parfois surprenantes. Je remercie également les autres membres du laboratoire avec qui j’ai partagé les salles de manip, les 3 pauses café et déjeuner et beaucoup de bons moments pendant ces quatre années. Une pensée particulière aux thésards et post-doc partis du laboratoire et qui ont contribué à faire de ces années un souvenir inoubliable : Roro, Jojo, Jéjé, M. Ndong et Linda. Il en va de même pour Fabien et Christopher qui ont en plus dû supporter la vision apocalyptique de mon bureau durant ces deux dernières années et qui seront les prochains à vivre l’expérience de la rédaction (courage les gars!!!). J’aimerai remercier à présent les membres de ma famille. Tout d’abord mes parents qui m’ont fait confiance et m’ont permis de reprendre mes études même si ça ne semblait pas gagné. Hélène, Mathieu, Sébastien, Tatiana, Marion et Justine pour leur soutien et pour l’intérêt qu’ils portent à mon travail. Ma belle-famille picarde et vosgienne qui a toujours cru en moi et m’a toujours encouragé. Un grand merci aux amis que j’ai la chance de connaitre depuis la maternelle pour certains, ou depuis le lycée ou l’université pour les autres : Bubub, Aurélie et Carla, Lapin, Pauline et Clémentine, Bourriquet, Jenny et Maxou, Dave, Camille et Elioth, Cyril et Diana et Oliv et Maïté. Qui aurait parié il y quelques années qu’on allait faire de moi un docteur? Vous avez été une véritable bouffée d’oxygène lors de chaque moment passé ensemble depuis le début de la rédaction même si ces derniers sont devenus trop rares. Mes dernières pensées vont vers Laëtitia. Tu m’as pris la main il y a huit ans et n’as cessé chaque jour de me guider et de me soutenir. Tu m’as permis d’arriver jusqu’ici aujourd’hui et de m’envoler vers le Danemark demain… Sans toi je ne serai jamais allé aussi loin. Merci pour ton aide précieuse jusqu’aux dernières lignes du manuscrit et d’avoir supporté le rythme étrange qui a accompagné cette longue période de rédaction. 4 SOMMAIRE LISTE DES FIGURES 9 LISTE DES TABLEAUX 12 ABREVIATIONS 13 INTRODUCTION GENERALE 15 SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 17 I- Le miscanthus 17 I-1 Origine 17 I-2 Physiologie de la plante 19 I-3 Culture du miscanthus 21 I-3-1 Implantation 21 I-3-2 Récolte 21 I-3-3 Fertilisation 22 I-3-4 Irrigation et traitement 23 II- Synthèse des principaux glucides non structuraux 24 II-1 Fixation du CO2 24 II-1-1 Différents types de photosynthèse 24 II-1-2 Métabolisme photosynthétique de miscanthus 25 II-1-3 Avantages du métabolisme des plantes C4 à enzyme malique NADP dépendante chloroplastique 27 II-2 Synthèse des glucides dans les feuilles en C4 28 II-2-1 Saccharose 28 II-2-2 Amidon 30 II-3 Synthèse des glucides de réserve 32 II-3-1 Amidon 32 II-3-2 Fructanes 33 II-3-3 Glucomannanes 35 III- Synthèse des molécules azotées 36 III-1 Absorption du nitrate et de l’ammonium 37 III-1-1 Absorption du nitrate 37 III-1-2 Réduction du nitrate en ammonium 38 III-1-2-1 Nitrate Réductase (NR) 38 III-1-2-2 Nitrite Réductase (NiR) 39 III-1-3 Absorption de l’ammonium 39 III-2 Assimilation de l’ammonium 39 III-2-1 Cycle GS/GOGAT 40 5 III-2-1-1 Glutamine synthétase (GS) 41 III-2-1-1-1 GS2 41 III-2-1-1-2 GS1 42 III-2-1-1-3 Régulation de l’expression de la GS 44 III-2-1-2 Glutamate synthase (GOGAT) 44 III-2-2 Glutamate déshydrogénase (GDH) 45 III-2-3 Asparagine synthétase (AS) 46 III-3 Synthèse des acides aminés et des protéines 48 III-3-1 Synthèse des acides aminés 48 III-3-2 Synthèse des protéines 50 IV- Transport et remobilisation des molécules carbonées et azotées 52 IV-1 Transport 52 IV-1-1 Transport des molécules carbonées 52 IV-1-2 Transport des molécules azotées 53 IV-2 Remobilisation 54 IV-2-1 Remobilisation des molécules carbonées 54 IV-2-2 Remobilisation des molécules azotées 56 OBJECTIFS DE L’ETUDE 59 MATERIELS ET METHODES 60 I- Matériel végétal 60 I-1 Dispositif 1 60 I-2 Dispositif 2 61 I-3 Dispositif 3 62 I-4 Dispositif 4 62 II- Méthodes d’analyse 64 II-1 Analyses élémentaires 64 II-2 Analyse des métabolites 67 II-2-1 Analyse des ions 67 II-2-2 Analyse des acides aminés libres 68 II-2-3 Dosage des glucides non structuraux 69 II-3 Analyse des protéines 74 II-3-1 Dosage des protéines solubles 74 II-3-2 Dosage des activités enzymatiques 74 II-3-3 Western-blots 79 II-4 Analyse RMN 81 II-5 Analyses cytologiques 83 II-6 Analyses statistiques 84 6 RESULTATS ET DISCUSSIONS 85 I- Stockage et dynamique saisonnière des glucides non structuraux dans les rhizomes et pousses de Miscanthus x giganteus. 85 I-1 Introduction 85 I-2 Matériel et méthodes 87 I-2-1 Matériel végétal et milieu expérimental 87 I-2-2 Extraction et dosages des glucides non structuraux 89 I-2-2-1 Extraction et dosage des sucres libres 89 I-2-2-2 Extraction et dosage de l’amidon 90 I-2-2-3 Extraction et dosage des fructanes et des glucommananes 90 I-2-3 Analyses cytologiques 90 I-2-4 Analyses statistiques 91 I-3 Résultats 92 I-3-1 Dosages enzymatiques des sucres 92 I-3-1-1 Etude des sucres de réserves des organes souterrains durant l’hiver 92 I-3-1-2 Etude des sucres dans les organes souterrains au cours de la croissance sur un cycle annuel 93 I-3-1-3 Etude des sucres dans les tiges au cours de l’année 96 I-3-1-4 Etude des sucres dans les feuilles au cours de l’année 98 I-3-2 Etude cytologique 101 I-4 Discussion 104 I-4-1 Stockage de glucides de réserve dans les parties souterraines de miscanthus en hiver 104 I-4-2 Remobilisation printanière des réserves carbonées des parties souterraines 105 I-4-3 Synthèse des glucides dans les feuilles en été et automne 106 I-4-4 Etude du saccharose 107 I-4-5 Reconstitution des réserves glucidiques 108 I-4-6 Bilan des flux glucidiques 109 I-5 Conclusion 112 II- L’asparagine et l’arginine jouent un rôle central dans le stockage et la remobilisation de l’azote chez Miscanthus x giganteus 113 II-1 Introduction 113 II-2 Matériel et méthodes 115 II-2-1 Matériel végétal et milieu expérimental 115 II-2-2 Extraction et dosages 117 7 II-2-2-1 Dosages C/N et excès isotopiques (15N) 117 II-2-2-2 Extraction des acides aminés 117 II-2-2-3 Dosage des acides aminés totaux 117 II-2-2-4 Dosage des acides aminés individuels 118 II-2-2-5 Extraction et dosage des protéines 118 II-2-2-6 Extraction et dosages des ions 118 II-2-2-7 Analyses statistiques 119 II-3 Résultats 120 II-3-1 Variation des quantités d’azote total chez Miscanthus x giganteus au cours du cycle de croissance : mise en évidence de trois phases clés 120 II-3-2 Etude des teneurs et des quantités d’azote dans les uploads/Management/ these-guillaume-lebas-11032013.pdf