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1 TECHNIQUES D’ANALYSES MICROBIOLOGIQUES OBJECTIFS DE CE TP A la fin du TP de t

1 TECHNIQUES D’ANALYSES MICROBIOLOGIQUES OBJECTIFS DE CE TP A la fin du TP de techniques d’analyses microbiologiques, chaque étudiant doit être capable de : - Caractériser un micro-organisme sur le plan morphologique, biochimique et métabolique - Faire un antibiogramme en évaluant la sensibilité d’un microorganisme à différents agents antibactériens - Maitriser l’ensemencement d’une galerie API - Maitriser la lecture des résultats d’une galerie API 2 SEANCE 1 : INTRODUCTION Un germe isolé et purifié peut subir un certain nombre de tests, conduisant à son identification. On réalise a cette effet, différentes observations portant sur : - Des caractères morphologique (micro et macroscopiques) - Des caractères physiologiques - Des caractères biochimiques et métaboliques - Des caractères immunologiques Tous ces tests se placent en fin d’analyse d’un produit (prélèvement pathologique etc…) et ne peuvent se faire que sur des souches microbiennes isolés et purifiées. Certains tests sont présomptifs, d’autres confirmatifs. L’association de certains de ces différents tests permet à l’aide d’un tableau dichotomique d’identification, de donner le genre ou l’espèce à laquelle appartient un microorganisme recherché. Etape d’une analyse conduisant à l’identification d’un microorganisme:  Produit à analyser  Sélection d’un type de microorganisme - Milieu nutritif électif - Milieu sélectif - Milieu nutritif différentiel - Milieu d’enrichissement  Isolement et purification sur tube incliné ou en boîte de Pétri  Identification d’un germe purifié - Des caractères morphologique (micro et macroscopiques) - Des caractères physiologiques - Des caractères biochimiques et métaboliques - Des caractères immunologiques 3 SEANCE 1 : LES CARACTERES MORPHOLOGIQUES DES BACTERIES I- LES CARACTERES MORPHOLOGIQUES 1. Macroscopiques L’observation de l’aspect macroscopique des colonies permet d’effectuer une première caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de l’identification. Les éléments d’identification macroscopiques sont : - Pour la gélose solide en boite de pétri et en tube incliné Forme Punctiforme, circulaire, ondulé, lobé, érodé, filamenteuse, rhizoïde, striation radiale, striation concentrique, en fuseau dans la masse Taille Diamètre de la colonie Couleur Pigmentation de la colonie ou autour de la colonie Opacité Transparente, translucide, opaque Hauteur ou coupe de la colonie Plate, élevé, convexe, en dôme, ombiliquée Surface Lisse, rugueuse, émoussée, brillante, sèche, poudreuse, plissée. Consistance Visqueuse, granulaire Odeur Présente ou absente - Pour le milieu nutritif liquide Trouble Intense, faible : pigmentation ou non. voile Masse cellulaire en surface, collerette Dépôt Agrégation de cellule au fond du tube Odeur Caractéristique 2. Microscopiques Ce sont les premiers tests à réaliser puisqu’ils peuvent décider de la voie d’identification à suivre (par exemple on ne ferra un test de catalase que pour différencier les bactéries GRAM + et ce test n’est pas effectué pour les bactéries GRAM - qui ne possèdent pas de catalase). 2.1. Observation à l’état frais 4 Ce test permet de déterminer la forme, l’arrangement et la mobilité des bactéries. Il consiste en l’observation d’une goutte de suspension bactérienne, préparée avec de l’eau physiologique et placée entre lame et lamelle. L’observation se fait sur microscope ordinaire. Technique - Déposer une goutte d'une culture en milieu liquide sur une lame de verre. - Recouvrir la goutte d'une lamelle couvre objet (la culture ne doit pas déborder les contours de la lamelle). - Observer immédiatement au microscope (objectif x10 ; x25 et x40) - Après observation jeter immédiatement la lame dans un bocal contenant de l'eau de Javel. 2.2. Techniques de coloration complexe : Coloration de Gram C'est une double coloration qui nous permet de connaître la forme, l'arrangement, la pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées. Cette coloration permet de classer les bactéries selon leur capacité à fixer le cristal violet. Celles qui possèdent une enveloppe externe sont décolorées lors du lavage à l’éthanol (Gram-), alors que celles qui n’en possèdent pas vont retenir le colorant (Gram+). Technique : - Préparer et fixer un frottis bactérien à la chaleur du bec Bunsen. - Recouvrir au violet de Gentiane pendant 1min. Eliminer l'excès par l'eau de robinet - Ajouter du Lugol : laisser agir pendant 1 minute. Eliminer l'excès par l'eau de robinet - Traiter à l'alcool 95° pendant 30 secondes, puis rinçage à l'eau de robinet; - Recolorer à la Fuschine pendant 1 à 2 minutes, rinçage à l'eau de robinet puis séchage. L'observation se fait à l’objectif x 100 en ajoutant de l'huile à immersion. Les bactéries Gram positif se colorent en violet alors que les Gram négatif se colorent en rose. 2.3. Techniques de colorations particulières : Coloration des spores : méthode au vert de Malachite Le but : Permet la mise en évidence des spores dans les bactéries. La Technique : - Faire un frottis des bactéries sur une lame propre et sèche ; - Sécher le frottis ; 5 - Fixer à l’alcool puis rincé à l’eau, ou à la flamme en passant trois fois dans la flamme (ou au-dessus du bec) ; - Colorer avec une solution de vert Malachite à 5% pendant 10 minutes ; - Rincer à l’eau distillée ; - Colorer à la safranine ou au mercurochrome à 5% pendant 1 minute ; - Rincer à l’eau distillée ; - Sécher. - Observer le frottis à l’immersion (objectif ×100). 6 SEANCE 2 : LES CARACTERES PHYSIOLOGIQUES II – LES CARACTERES PHYSIOLOGIQUES 1. Sensibilité des cellules aux facteurs environnants (en milieu liquide). 1.1. Influence de la température d’incubation Chaque microorganisme a une température optimale de croissance que l’on peut aisément déterminer, en incubation à différentes températures (5, 20, 37, 55°C) pendant 2 à 7 jours, les tubes contenant le micro- organisme à tester. 1.2. Influence de la température sur la cellule = résistance. Il s’agit ici de mesurer la thermorésistance des cellules, les formes les plus résistantes à la chaleur étant les spores. Pour cela, une culture liquide de 24 h (au moins) est traitée à 60°C et à 80°C pendant des temps compris entre 1 et 20 minutes, les tubes traités sont refroidis et 0,1ml est étalé à la surface d’une gélose nutritive. Seules les formes ayant supporté la chaleur donneront des colonies. 1.3. Influence de la pression osmotique du milieu sur la croissance Il s’agit ici de mesurer l’effet de la pression osmotique sur la croissance. Par exemple, le staphylocoque supporte des concentrations en NaCl de 75 g/l. 2. Mobilité (voir ci-dessous) 3. Etude des types respiratoires 3.1. Culture en aérobiose Les microorganismes aérobies peuvent être cultivés sur milieu gélosé incliné en tubes ou en boites de Pétri. L’ensemencement s’effectue en surface par stries (ou étalement au râteau dans les boites). La culture se développe en surface. - La culture en tubes de milieu liquide bouchés coton cardé ne permet qu’une aérobiose incomplète. On l’utilise dans le cas où le rendement de culture importe peu. - Incubation à 37°C pendant 24 heures. 3.2. Culture en anaérobiose 7 - Une anaérobiose partielle avec atmosphère enrichie en CO2 peut être facilement réalisée en utilisant un récipient fermé (dessiccateur) dans lequel on place une bougie allumée à côté des boites de Pétri ou des tubes de milieux. Le récipient est fermé et la bougie s’éteint au bout de quelques instants en ayant consommé de l’oxygène et libéré du gaz carbonique. - Incubation à 37°C pendant 24 heures. Lecture: Lorsqu’il y a une croissance, la bactérie est anaérobie. Remarque : pour la distinction de tous les types respiratoires (aérobie, anaérobie stricts, micro-aérophile, aéro- anaérobie facultatifs) on ensemence les germes dans la gélose VF (viande foie sans nitrate). 8 SEANCE 3 : LES CARACTERES BIOCHIMIQUES ET METABOLIQUES II. LES CARACTERES BIOCHIMIQUES ET METABOLIQUES Grâce à cette étude, il est possible de connaître certaines caractéristiques du métabolisme des bactéries isolées. Les tests biochimiques permettent donc de vérifier si la bactérie a un métabolisme oxydatif ou fermentatif, s’il y a formation d’un acide à la suite de l’utilisation d’un hydrate de carbone (ex : glucose, arabinose, sorbitol ...), si un composé particulier est utilisé comme seule source de carbone (ex : citrate, malonate ...), si un acide aminé peut être transformé (ex : arginine, lysine, tryptophane ...), si un enzyme particulier est présent (ex : oxydase, catalase, pectinase ...) ou si des molécules complexes sont dégradées (ex : gélatine, amidon ...). A – Propriétés métaboliques de respiration 1. Mise en évidence de la catalase Principe: La catalase est un enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2) avec dégagement d'oxygène selon la réaction suivante. Technique: Sur une lame, déposer quelques gouttes d’eau oxygénée (à 10 volumes) ; suspendre alors une colonie (ou une goutte de bactéries provenant d’un milieu liquide) à l’aide d’une pipette Pasteur (risque de faux positifs avec du matériel métallique comme l’anse de platine). Lecture: Si la catalase est présente ; il y a dégagement gazeux ou effervescence. (Bulle d’O2) : germe Catalase+. Dans le cas contraire ; Catalase - : pas d'effervescence. Remarque : vérifier que l’eau oxygénée n’est pas dénaturée. 2. Mise en évidence de l’oxydase = cytochrome oxydase. 9 Principe Ce test permet la détection de la phénylène-diamine-oxydase ou le cytochrome oxydase; enzyme entrant dans divers couples d'oxydoréduction. Agissant sur un substrat incolore, cet enzyme uploads/Philosophie/ techniques-d-x27-analyses-microbiologiques-abb-3.pdf