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4 — LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°5 Juillet-Août 2007 Historique Le séque

4 — LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°5 Juillet-Août 2007 Historique Le séquençage de l’ADN a été inventé dans la deuxième moitié des années 1970. Deux méthodes ont été développées indépendamment, l’une par l’équipe de Walter Gilbert, (Maxam and Gilbert 1977) aux États- Unis, et l’autre par celle de Frederick Sanger (Sanger, Nicklen et al. 1977) en Grande-Bretagne. Ces deux méthodes sont fondées sur des principes diamétralement opposés : l’approche de Sanger est une méthode par synthèse enzymatique sélective, tandis que celle de Maxam et Gilbert est une méthode par dégradation chimique sélective. Pour cette Évolution des techniques de séquençage Résumé: La biologie analytique a connu depuis quelques années une grande révolution en conséquence des progrès technologiques de la biologie moléculaire appliquée au séquençage des génomes. En effet, connaître l’enchaînement complet des bases nucléotidiques qui constituent un génome, c’est connaître toute l’information nécessaire à la vie (du moins en théorie). Ce n’est que récemment, avec la mise en place des Programmes Génome, que de nombreux génomes, dont celui de l’être humain, sont aujourd’hui séquencés, et que d’autres génomes sont en voie de l’être dans des délais de plus en plus raccourcis. Ces réalisations spectaculaires, sont rendues possible grâce aux développements extraordinaires des techniques de séquençage que nous essayons de passer en revue dans cet article. Nous rappellerons dans un premier temps le principe de base et l’évolution des techniques traditionnelles (Sanger, Maxam et pyroséquençage). Nous discuterons les avantages et les inconvénients de chaque approche avant d’exposer la nouvelle génération de séquenceurs automatisés. EL FAHIME Elmostafa1 and Ennaji Mly Mustapha2 1* Unités d’Appui Technique à la Recherche Scientifique UATRS, Plateforme Biologie moléculaire et Génomique Fonctionelle, CNRST, RABAT elfahime@cnrst.ma 2* Laboratoire de Virologie, Hygiène et Microbiologie, FST Mohammadia, Université Hassan II - Mohammadia. Article de synthèse LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°5 Juillet-Août 2007 — 5 découverte, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le prix Nobel de chimie en 1980 (Kolata 1980). Par ailleurs, la première méthode non Sanger ayant fait ses preuves dans le domaine de séquençage a été introduite en 1988 Ronaghi, Uhlen et al. 1998, Hyman et al. 1988), il s’agit de pyroséquençage, une technique principalement basé sur l’addition d’un seul nucléotide qui est révélé en temps réel par détection de la luminescence. Le début du 21 siècle est marqué par l’avènement de la nouvelle génération des techniques de séquençage, il s’agit en faite de méthodologies nouvelles ou adaptées de séquençage, découlant des avancées technologiques issues de l’évolution des connaissances en physique, informatique, chimique, nanotechnologie et en biotechnologie. Ces innovations technologiques visent à réduire le coût et le temps nécessaire pour le séquençage génome complet, en se basant sur la miniaturisation et le groupage parallèle des réactions dans des volumes très restreint. Deux exemples concernant des technologies novatrices ayant fait leurs preuves dans le séquençage à haut débit de génome complet, à savoir la technologie 454 et la technologie Solexa, seront décrite également. Principe de la Méthode de Maxam & Gilbert (1977) Cette méthode utilise des échantillons d’ADN double brin et ne nécessite donc pas le clonage de l’ADN dans un vecteur pour produire de l’ADN simple brin comme c’est le cas pour la méthode de Sanger. Cette méthode est basée sur une dégradation chimique de l’ADN et utilise les réactivités différentes des quatre bases A, T, G et C, pour réaliser des coupures sélectives. Les réactifs sont résumés dans le tableau 1. En reconstituant l’ordre des coupures, on peut remonter à la séquence des nucléotides de l’ADN correspondant. Tableau 1 : Principaux Agents chimiques utilisés pour la méthode de séquençage de Maxam et Gilbert Bases Altération des bases Suppression des bases Coupure du brin G diméthylsulfate piperidine piperidine A+G acide acide piperidine C+T hydrazine piperidine piperidine C hydrazine + alkali piperidine piperidine A>C alkali piperidine piperidine On peut décomposer ce séquençage chimique en six étapes successives (fig 1): 1. Marquage: Les extrémités des deux brins d’ADN à séquencer sont marquées par un traceur radioactif (32P). Cette réaction se fait en général au moyen d’ATP radioactif et de polynucléotide kinase. 2. Isolement du fragment d’ADN à séquencer. Celui- ci est séparé au moyen d’une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide. Le fragment d’ADN est découpé du gel et récupéré par diffusion. 3. Séparation de brins: Les deux brins de chaque fragment d’ADN sont séparés par dénaturation thermique, puis purifiés par une nouvelle électrophorèse. 4. Modifications chimiques spécifiques: Les ADN simple-brin sont soumis à des réactions chimiques spécifiques des différents types de base. Walter Gilbert a mis au point plusieurs types de réactions spécifiques, effectuées en parallèle sur une fraction de chaque brin d’ADN marqué. Par exemple une pour les G (alkylation 6 — LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°5 Juillet-Août 2007 par le diméthyle sulfate), une pour G et les A (dépurination), une pour les C et une pour les C et les T (hydrolyse alkaline). Ces différentes réactions sont effectuées dans des conditions très ménagées, de sorte qu’en moyenne chaque molécule d’ADN ne porte que zéro ou une modification. 5. Coupure. Après ces réactions, l’ADN est clivé au niveau de la modification par réaction avec une base, la pipéridine. 6. Analyse. Pour chaque fragment, les produits des différentes réactions sont séparés par électrophorèse et analysés pour reconstituer la séquence de l’ADN. Cette analyse est analogue à celle que l’on effectue pour la méthode de Sanger. La méthode de Maxam et Gilbert nécessite des réactifs chimiques toxiques et reste limitée quant à la taille des fragments d’ADN qu’elle permet d’analyser (<250 nuclétoides). Moins facile à robotiser, son usage est devenu aujourd’hui confidentiel. Principe de la Methode de Sanger et Nicklen 1977 Cette méthode est basée sur l’interruption de la synthèse enzymatique d’un brin d’ADN complémentaire (arrêt d’élongation). L’ADN à séquencer est cloné et de nombreuses molécules d’ADN simple brin sont produites. Une courte amorce d’oligonucléotides (généralement synthétisée chimiquement et éventuellement marquée) est ajoutée à l’ADN. Le point de fixation de l’amorce sert de point de départ pour la synthèse du brin complémentaire. La polymérase est alors ajoutée avec : - les 4 nucléotides normaux : d-ATP, d- CTP, d-GTP et d-TTP (au moins un d’entre eux est marqué au phosphore 32, au soufre 35 ou au Phosphore 33) ; - une faible concentration de 4 nucléotides analogues dans des incubations séparées. Les analogues sont des didésoxynucléotides (ddNTP) qui sont identiques aux nucléotides normaux sauf que les groupes hydroxyles (OH) des riboses sont remplacés par des hydrogènes (H). La polymérase ne peut pas distinguer ce substrat des nucléotides normaux. La synthèse du brin d’ADN complémentaire est initiée au niveau de l’amorce. L’intégration d’un didésoxynucléotide dans le brin synthétisé entraîne l’arrêt de l’élongation en raison de l’absence du groupement OH, nécessaire à l’extension. Les 4 incubations contiennent donc un mélange de molécules partiellement synthétisées d’ADN double brin marqué. La longueur des fragments d’ADN varie en fonction du point d’intégration du didésoxynucléotide. Comme cette intégration est aléatoire, l’ensemble des molécules dans un mélange représente l’ensemble des positions pour une base particulière. Les 4 mélanges sont analysés simultanément sur un gel d’électrophorèse. Celui-ci contient un composé qui entraîne la dénaturation de l’ADN double brin et le processus est mené sous un voltage fort pour éviter la réassociation des brins. Comme pour la méthode précédente, les bandes sont révélées par autoradiographie et la séquence est lue directement sur le gel (figure 2). Une adaptation de cette technique consiste à marquer les didésoxynucléotides plutôt que les amorces, ce qui permet de n’utiliser qu’un seul mélange au lieu des quatre nécessaires dans le cas d’un marquage des amorces. Chaque didésoxyribonucléotides est marqué par un LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - N°5 Juillet-Août 2007 — 7 fluorophore spécifique. Les fragments d’ADN synthétisés portent ce fluorophore terminal. On les appelle des terminateurs d’élongation ou “BigDye Terminators” ou “Dye-labeled terminator”. Dans ce cas on parle d’un séquençage par arrêt de synthèse à l’aide d’un terminateur marqué «dye terminator sequencing» proposé par Smith et al., (Smith, Sanders et al. 1986). C’est la technique actuellement utilisée dans certains séquenceurs automatisés. Ci-dessous, un exemple de structures de ddNTP fluorescents : Automatisation de la technique de Sanger Au cours des 25 dernières années, la méthode de Sanger a été largement développée grâce à plusieurs avancées technologiques importantes : • La mise au point de vecteurs de séquençage adaptés, comme le phage M13 développé par Joachim Messing au début des années 1980 (Messing 1983). • Le développement de la synthèse chimique automatisée des oligonucléotides qui sont utilisés comme amorces dans la synthèse. • L'introduction de traceurs fluorescents à la place des marqueurs radioactifs utilisés initialement. Ce progrès a permis de sortir le séquençage des pièces confinées, réservées à l'usage des radioisotopes. • L'adaptation de la technique PCR pour le séquençage. • L'utilisation de séquenceurs automatiques de gènes • L'utilisation de l'électrophorèse capillaire pour la séparation et l'analyse A côté des séquenceurs en gel plat, les séquenceurs capillaires ont apporté une plus grande automatisation dans les laboratoires de plus en plus demandeurs en séquençage de routine. La technique de Sanger est celle qui est mise uploads/Science et Technologie/ chap-2 1 .pdf