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Produire des biocarburants à partir de micro- algues : quels enjeux pour la rec

Produire des biocarburants à partir de micro- algues : quels enjeux pour la recherche ? Gilles Peltier Institut de Biologie Environnementale et Biotechnologie CEA, CNRS, Université Aix Marseille CEA Cadarache gilles.peltier@cea.fr hydrogène biodiésel hydrogène Les biocarburants de 2ème et 3ème générations Micro-organismes photosynthétiques Un enjeu pour la société et pour la recherche 2G Biomasse ligno-cellulosique 3G Micro-organismes photosynthétiques Pilotes Démonstrateurs Recherche Les micro-algues et les cyanobactéries … une biodiversité à peine explorée : 30 000 espèces décrites 200 000 à 1 million estimées 40 à 50% de la photosynthèse terrestre À l’origine de la formation du pétrole Biomasse plantes supérieures ν biomasse algale CO2 H2O O2 N, P, S,… H2 amidon lipides hydrogène CO2 H2O O2 N, P, S,… H2 amidon lipides hydrogène Amidon Lipides Hydrogène 4-5 14-22 12-17 51-58 Chlorella vulgaris - 21 17 48 Chlamydomonas rheinhardii 3-6 12-14 10-17 50-56 Scenedesmus obliquus ARN / ADN Lipides Carbohydrates Protéines Algue (%, poids sec) Lignine Hémicellulose Cellulose Protéines Earthrise Algae Farm, Calipatria, California, USA, Culture en bassins ouverts sur 22 ha Culture en bassins ouverts Les différents systèmes de culture de microalgues - Bassins (raceway ponds) ouverts ou fermés (sous serre) - Photobioréacteurs tubulaires - Sac plastiques Vue futuriste d’une ferme de microalgues cultivées en photobioréacteurs (Solix biofuels Colorado, USA) Photobioréacteur tubulaire solaire (Algatech, désert du Negev, Israël) Photobioréacteur plan pour la production de chlorelles (O.Pulz, Allemagne) Parry Nutraceuticals Ltd., Spirulina Ponds, India Culture de microalgues pour la production de composés HVA D’après M. Tredici, EABA Meeting, Florence, 2009 Production de microalgues : avantages et inconvénients 10-15 10-30 50-70 Productivité observée (T.ha-1.an-1) Photobioréacteurs Champ 30 60 150-180 Productivité maximale (T.ha-1.an-1) Plantes C3 Plantes C4 (sorgho, maïs,…) Microalgues D’après « EPOBIO project » University of York – Sept 2007 150 T.ha-1.an-1 = 40 g. m-2.s-1 (sur 365 jours) - Recours aux conditions de carence pour induire l’accumulation de produits riches en énergie - Pas d’amélioration génétique (adaptation aux systèmes de cultures) - Systèmes de cultures et de récolte coûteux - Productivité surfacique élevée - Composition de la biomasse flexible - Peu de compétition avec la production alimentaire - Peu de compétition avec les ressources en eau - Recyclage de déchets urbains (N, P, S,..) ou industriels (CO2) Inconvénients Avantages Des microalgues pour la production de biocarburants ? • Production d’hydrogène • Production de lipides et de biodiesel PQ Pc H2O Cyt b6/f NADPH PS II PS I FNR QA Fixation du CO2 O2 Rubisco CO2 Amidon Fd H2ase H+ H2 H2/H+ Les limites thermodynamiques Cycle Photosynthétique de Réduction du Carbone RuBP 1 CO2 3-PGA (2) RuP Triose-P ATP (1) ATP (2) NADPH (2) 3 ATP 2 NADPH CO2 ATP/NADPH ratio : 1,5 Rubisco Calvin cycle PQ Pc 2 H2O Cyt b6/f 2 NADPH PS II PS I FNR QA 2H+ + O2 Fd 8 Photons Photons PAR 217 KJ. mole-1 en moyenne 1 mole fixed CO2 est équivalent à 475 KJ (1/6 mole glucose) Conversion théorique maximale du PAR en énergie chimique (biomasse) : 475 KJ / (217 x 8 KJ ) = 27% PAR (Photosynthetic Active Radiation) : ~ 45% de l’énergie solaire Conversion photosynthétique maximale : 27% x 45% = 12 % ATP H+ H+ H+ H+ ADP+Pi 2 4 6 DCMU Temps (min) Concentration (µM) 0 1 2 3 4 H2 O2 Control 0 0 1 2 3 hν ν ν ν hν ν ν ν Deux stratégies de recherche : 1. séparer dans le temps productions d’O2 et d’H2 2. rendre l’hydrogénase insensible à l’O2 Un verrou : la sensibilité de l’hydrogénase à l’O2 Production d’hydrogène: mécanismes et verrous biologiques O2 Carence en soufre Activation hydrogénase Phase 1 (0 to 40h) Aérobiose Phase 2 (40 to 120h) Anaérobiose Chute du PSII & accumulation d’amidon Production d’H2 en réponse à une carence en soufre (Melis et al., 2000) H2 H+ Temps (H) 0 24 48 72 96 120 144 168 Amidon (mg.mL-1) 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 Hydrogène (mL.L-1 de culture) 0 10 20 30 40 50 60 Oxygène (%) 0 5 10 15 20 25 Amidon H2 O2 Contrôler le stockage et le déstockage de l’amidon S’affranchir de la carence et stimuler la voie indirecte de production d’H2 Contrôler l’activité du Photosystème II 2 4 6 DCMU Temps (min) Concentration (µM) 0 1 2 3 4 H2 O2 Control 0 0 1 2 3 hν ν ν ν hν ν ν ν Identifier les voies métaboliques et leurs étapes limitantes Quelle enzyme est impliquée dans la réduction des PQs ? Starch CO2 fixation ? A la différence des plantes supérieures, les chloroplastes de Chlamydomonas ne possèdent pas de complexe NAD(P)H déshydrogénase (NDH-1) de type I 6 NDH-2 dans le génome de Chlamydomonas Collaboration F. Franck & C. Remacle, Liège Nda2: une déshydrogénase chloroplastique de type II NAD(P)H Jans et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2008) 75 50 37 100 T M C S Desplats et al. J. Biol. Chem. (2009) Développement d’approches génétiques Starch CO2 fixation Starch Starch CO2 fixation Photochemistry Fluorescence Thermal dissipation Mise en place de deux cribles - Déstockage de l’amidon - Régulation de la photosynthèse AphVIII Constitution d’une banque de mutants d’insertion (15,000 mutants) Croissance photoautotrophe sur milieu sélectif (paromomycine) Actinic light F/Fo Time (s) Modulated light Modulated light Enregistrement des transitoires de fluorescence de la chlorophylle sur des colonies isolées Crible de mutants basé sur la fluorescence de la chlorophylle Actinic light F/Fo Time (s) Modulated light Modulated light Crible de mutants basé sur la fluorescence de la chlorophylle 3 mutants 204D1,216A3,125D1 Fluorescence induction (Kausky effect)(+/-) III Dark reduction of PQ (+/-) High Fo High steady state Fluorescence 7 mutants 216E1,79H5, 119B1, 220C2, 133G6, 74G3, 228F1 IV 3 mutants 94E4, 113A3, 220B2 II 2 mutants 7A2, 9H4 I time (s) 0 60 120 180 240 300 360 chlorophyll fluorescence (r.u.) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 WT 204D1 APHVIII pgrl1 WT pgrl1 WT c PGRL1 e pgrl1 WT d Pgrl1 Actin1 exon 1 2 3 b PGRL1 APHVIII +842 Chr 7 APHVIII pgrl1 WT pgrl1 WT c PGRL1 e pgrl1 WT d Pgrl1 Actin1 exon 1 2 3 b PGRL1 APHVIII +842 Chr 7 Isolement d’un mutant affecté dans le gène PGRL1 WT WT WT pgrL1 pgrL1 pgrL1 RT-PCR Immuno-détection Southern AphVIII - Insertion unique de la cassette de résistance à la paromomycine - Co-ségrégation parfaite entre phénotype et résistance à la paromomycine DalCorso et al. (2008) Cell 132: 273-285 22 +/- 2.05 46 +/- 3.61 Transfert cyclique/ anaérobiose (s-1) 18.8 +/- 1.33 31.4 +/- 1.85 Transfert cyclique/ aérobiose (s-1) pgrL1 WT Activité réduite du transfert cyclique des électrons chez pgrL1 Tolleter et al. (2010) à soumettre Light intensity (µE.m-2.s-1) 0 200 400 600 800 1000 ETR 0 20 40 60 80 100 a pgrL1 WT PQ(H2) NAD(P)H PS II QA CO2 Starch FNR PS I Fd Nda2 Pc Cyt b6 f Rubisco ADP + Pi ATP H+ 2 H+ O2+ 4 H+ 2 H2O PGRL1 NAD(P)H Photosynthetic CO2 fixation x y pgrL1 est affecté dans le transfert cyclique d’électrons H2ase 2 H+ H2 H+ PGR5 time (min) 5 10 15 time (min) 0 5 10 H2 (µmol.L -1 .µg -1 chlorophylle) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 + FCCP a b Forte stimulation de la production d’ H2 chez pgrL1 WT pgrL1 pgrL1 WT +FCCP control initial speed WT PGRL1 H2 production (µmol/L/min/µg chlorophlyll) 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 total production WT PGRL1 cumulative H2 production (µmol/L/µg chloro) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 B A pgrL1 pgrL1 WT WT initial speed WT PGRL1 H2 production (µmol/L/min/µg chlorophlyll) 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 total production WT PGRL1 cumulative H2 production (µmol/L/µg chloro) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 B A pgrL1 pgrL1 WT WT Tolleter et al. (2010) à soumettre µmol H2 / 109 cells 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 µmol H2/109 cells 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 tim e (h ) 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 starch (µg/106 cells/mL) 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 ∗ tim e (h ) 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 Starch (µg / 106 cells/mL) 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 b a c d Stimulation de la production d’H2 en carence en soufre WT WT pgrL1 pgrL1 pgrL1 WT WT pgrL1 Tolleter et al. (2010) à soumettre H2 production (µmol. H2 10-9 cells) starch (µg 10-6 cells) Voie directe Voie indirecte + DCMU PQ(H2) NAD(P)H PS II QA CO2 Starch FNR PS I Fd Nda2 Pc Cyt b6 f Rubisco ADP + Pi ATP H+ 2 H+ O2+ 4 H+ 2 H2O PGRL1 NAD(P)H Photosynthetic CO2 fixation x y En anaérobiose le gradient de protons limite le flux uploads/Science et Technologie/ upl2110614224575336512-peltier7avril.pdf