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31/05/2012 1 Méthodes dʼisolement dʼune bactérie, Antibiogramme Emilie Bessède,

31/05/2012 1 Méthodes dʼisolement dʼune bactérie, Antibiogramme Emilie Bessède, Laboratoire de Bactériologie, CHU Pellegrin Etapes classiques du diagnostic bactériologique • Mise en culture du prélèvement • Examen microscopique (direct) - numération leucocytaire (état frais) - coloration de Gram • Identification +/- antibiogramme • Examen macroscopique 31/05/2012 2 Examen macroscopique • trouble, GR, débris, odeur… • GB, GR, bactéries, levures, cristaux… • numération leucocytaire Examen microscopique (1) 31/05/2012 3 • Coloration du prélèvement par la coloration de Gram Examen microscopique (2) • Morphologie des bactéries - bacilles - cocci • Couleur - rose : Gram négatif - violet : Gram positif 31/05/2012 4 Streptocoque Méningite à N. meningitidis coloration de Gram 31/05/2012 5 Méningite à N. meningitidis coloration de Gram Ensemencement • Incubation dans une atmosphère adaptée • Milieux de culture adaptés aux bactéries à rechercher - gélosés, ou liquides - ordinaires, enrichis ou sélectifs • Délai de culture variable • Obtention des bactéries en culture nécessaire à lʼidentification et aux tests de sensibilité aux antibiotiques 31/05/2012 6 Techniques d’ensemencement • calibré : quantification des bactéries possible (ECBU, LBA..) • en quadrants Exemple de différents milieux utilisés • LBA, – Géloses au sang – Géloses chocolat – Gélose BCP • Urines – BCP • LCR – Géloses au sang – Géloses chocolat – Bouillons 31/05/2012 7 Incubation des différents milieux • Atmosphère à 37°C plus ou moins enrichie en CO2 • Atmosphère anaérobie à 37°C Identification des bactéries • Couleur, aspect, odeurs des colonies - gélosés ou liquides - ordinaires, enrichis ou sélectifs • Exigences de culture • Recherche de caractères respiratoires - oxydase, catalase • Recherche de caractères biochimiques - galeries dʼidentification 31/05/2012 8 Identification des bactéries Automatisation des identifications • Utilisation de galeries automatisées et miniaturisées : – Délai de 8 à 24h 31/05/2012 9 Principe de la spectrométrie de masse MALDI-TOF Visualisation dʼun spectre 31/05/2012 10 Tableau de scores Interprétation des cultures • La ou les bactéries isolées sont elles potentiellement pathogènes? • Réalisation dʼun antibiogramme - en milieu gélosé - en milieu liquide automatisé • La ou les bactéries isolées sont elles en situation pathogène? 31/05/2012 11 Lʼantibiogramme • C'est la détermination de la sensibilité d'une bactérie aux antibiotiques • Intérêt : comparer la valeur de la CMI d'un antibiotique par rapport à celle de deux concentrations critiques c et C (mg/L). Il permet de catégoriser la souche à étudier en confrontant la CMI d'un antibiotique donné à celle de la concentration c ou C Catégorisation clinique: S,I,R • Souches Sensibles Probabilité de succès thérapeutique forte en cas de traitement systémique à posologie recommandée (AFSSAPS) • Souches Résistantes Forte probabilité dʼéchec thérapeutique quel que soit le type de traitement et la posologie • Souches Intermédiaires Succès thérapeutique imprévisible car: - dissociation in vitro - in vivo - mécanisme de résistance faible cédant à une forte concentration locale ou à une augmentation de posologie - recouvre les incertitudes techniques et biologiques 31/05/2012 12 • Définition : + faible concentration dʼantibiotique qui inhibe tout croissance bactérienne visible à lʼœil nu. • En milieu liquide • En milieu solide • Antibiogrammes • E-TEST Détermination de la CMI Non réalisé en routine Antibiogramme en milieu gélosé Réalisation d’une suspension bactérienne à partir de la bactérie isolée Ensemencement sur la gélose Dépôt des disques 24h d’incubation Lecture de l’antibiogramme 31/05/2012 13 Lecture des boîtes • Catégorisation : diamètre, courbe de concordance, S, I ou R – Lʼantibiotique déposé diffuse au sein de la gélose et réalise ainsi un gradient de concentration – Le diamètre dʼinhibition autour du disque est proportionnel à la CMI, et comparé au diamètre critique • Lecture interprétative, basée sur la connaissance des phénotypes de résistance Exemples d’interprétation K. pneumoniae BLSE : image en « bouchon de champagne » 31/05/2012 14 P. aeruginosa: détection d'une carbapénémase de la classe B (VIM-2) par la méthode de diffusion (pour les antibiotiques en jaune, apport de 20 µl d'une solution de EDTA) E. coli, hyperproductrice de sa céphalosporinase chromosomique a été examinée d'une part vis-à-vis d'un milieu de Mueller-Hinton normal (à droite) et d'autre part vis-à-vis d'un milieu de Mueller- Hinton supplémentée en cloxacilline (300 mg/L) (à gauche) 31/05/2012 15 E-Test • Définition : technique de diffusion en gélose qui permet une estimation directe et rapide de la CMI dʼun antibiotique donné vis-à-vis dʼune souche bactérienne • Bandelette – Sur un côté : échelle de CMI (µg / mL) – Autre côté : gradient de concentrations croissantes de lʼAB Intérêts des E-tests • Validé pour de nombreuses espèces bactériennes • Intérêt pour PSDP • Glycopeptides (méthode des disques insuffisante) • Estimation du niveau de sensibilité dʼune souche en cas dʼinfection grave • Coût élevé 31/05/2012 16 Antibiogrammes automatisés 80-85 cupules -1 témoin de croissance -3 à 5 cupules/ATB pour les Gram – -3 à 6 cupules/ATB pour les Gram + -ensemencement manuel Bactéries antibiogrammées -entérobactéries et non fermentants -staphylocoques -streptocoques -entérocoques • Détermination de la CMI réelle : - minimum 3 dilutions par antibiotique… • Technologie basée sur une double lecture : - réaction colorée d’un indicateur redox (Bleu Alamar, métabolisme) - turbidité pour mesurer la croissance CMI 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 16,0 32,0 Principe de lecture des ATB Phoenix 31/05/2012 17 Intérêts et limites des automates • Gain de temps • Calibration rigoureuse des suspensions bactériennes • Estimation réelle des CMI • Pas d’images de mécanismes de résistance • Vérification de la pureté de l’inoculum impossible sur l’automate Particularités des hémocultures Prélèvement Incubation & détection de la croissance bactérienne automatisées Etat frais Gram Isolement/repiquage sur géloses Identification des colonies Réalisation dʼun antibiogramme Rendu des résultats Résultat rendu négatif Positif Négatif après 5 jours d’incubation, sauf cas particuliers 31/05/2012 18 Traitement des hémocultures positives • Systèmes automatiques alarme • 4 étapes 1. Gram 2. Ensemencement sur milieu solide • Pas de recommandations • Adaptés selon le Gram – GS, aérobie, 37°C, 24h – GS, anaérobie, 37°C, 48h – Chocolat, CO2, 37°C, 24h – BCP, 37°C, 24h 3. Lecture et identification des colonies 4. Antibiogramme Conclusion • Automatisation de plus en plus présente au laboratoire de Bactériologie • Étape de « pousse » des bactéries inévitable, retardant souvent le diagnostic ! • Développement de la biologie moléculaire … 31/05/2012 19 uploads/Societe et culture/ isolement-d-x27-une-bacterie-antibiogramme-dr-bessede.pdf