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La pcr en temps reel ppt Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie INRA TOULOUSE La PCR en temps réel Choix d ? amorces et analyse des résultats Pascal MARTIN Pascal Martin toulouse inra fr UR janvier CPlan La PCR en temps réel pour la mesure de l ? expres

Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie INRA TOULOUSE La PCR en temps réel Choix d ? amorces et analyse des résultats Pascal MARTIN Pascal Martin toulouse inra fr UR janvier CPlan La PCR en temps réel pour la mesure de l ? expression des gènes Principes de base Le choix des amorces de PCR La mise au point d ? un dosage en SYBR Green Les choix méthodologiques pour l ? analyse des résultats UR janvier CLa PCR en temps réel pour la mesure de l ? expression des gènes Mesurer l ? expression d ? un gène ? mesurer l ? abondance des transcrits produits par ce gène à un instant donné Abondance relative unités arbitraires ou abondance absolue nombre de copies ou g L En pratique la quanti ?cation relative est la plus utilisée en raison de la di ?culté qu ? il y a à construire une courbe de calibration absolue l ? utilisation de plasmides ou de produits de PCR est dangereuse ? UR janvier CLa PCR en temps réel pour la mesure de l ? expression des gènes Etapes initiales Organe Cellules Extraction ARN ARN total Traités vs non traités Sauvage vs transgénique Dosage Transcription inverse ADNc Dosage au spectrophotomètre A nm pas d ? évaluation d ? une potentielle dégradation di ?érentielle des ARNs Transcription inverse pas d ? évaluation des di ?érences potentielles d ? e ?cacité de transcription inverse IL EST NECESSAIRE DE CALIBRER NOS DONNEES PAR RAPPORT A UNE QUANTITE QUI EST CONSTANTE ENTRE LES DIFFERENTS ECHANTILLONS D ? ARN INTACT UR janvier Contrôle endogène gène de ménage housekeeping gene CLa PCR en temps réel pour la mesure de l ? expression des gènes bo? tes de cellules identiques A et B ARNA non dégradé ARNB dégradé à RTA et RTB e ?caces à gène X A gène X B ?- actin A ?-actin B Je calibre Je ne calibre pas gène X A ?-actin A gène X A gène X B ?-actin B gène X B Idem mais cette fois-ci e ?cacité RTB gène X B et ?actin B Je calibre Je ne calibre pas UR janvier gène X A ?-actin A gène X B ?-actin B gène X A gène X B CPrincipes de base Fluo DNA quantity Not detected Linear phase Exponential phase Plateau phase UR janvier Cycle number CPrincipes de base Fluo DNA quantity UR janvier Linear phase Exponential phase Cycle number CPrincipes de base ?Rn ROX normalized signal ?? ROX normalized baseline signal Ct threshold Baseline Nombre de cycles UR janvier CPrincipes de base ?Rn Distance cycle Nombre de cycles Dilutions au ème cycles de distance UR janvier CPrincipes de base l ? accumulation de la uorescence est proportionnelle à l ? accumulation du produit de PCR qui nous intéresse notion de spéci ?cité choix des primers L ? e ?cacité de PCR doit être la même dans les di ?érents échantillons Le seuil utilisé dans les analyses doit être ?xé de manière à couper toutes les courbes de