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FICHE TECHNIQUE PROTOCOLE D ? EXTRACTION DE L ? ADN PLASMIDIQUE Principes généraux C ? est une technique de séparation biochimique par précipitations di ?érentielles et séparation des phases obtenues liquide solide par centrifugation Protocole Récupération et lavage des cellules Prélever ml de suspension bactérienne placer en microtubes stériles Centrifuger à g pendant minutes Eliminer le surnageant Ajouter ml de suspension bactérienne Centrifuger à g pendant minutes Eliminer le surnageant Remettre le culot en suspension dans ??l de tampon Tris-HCl mM pH EDTA mM Lyse des cellules Ajouter ??l de soude M SDS préparés extemporanément Laisser agir minutes au plus Puri ?cation de l ? ADN plasmidique Ajouter ??l d ? acétate de sodium M pH pour réaliser la précipitation de l ? ADN chromosomique dénaturé par la soude et des protéines complexées par le SDS détergent Mélanger par retournements successifs à X Placer les tubes dans la glace pendant minutes Centrifuger minutes à g à température ambiante Récupérer le surnageant volume v Ajouter v d ? éthanol absolu à ?? C et placer à ?? C pendant minutes pour précipiter l ? ADN plasmidique Centrifuger minutes à g et à C Eliminer le surnageant Remettre le culot en suspension dans ??l d ? éthanol à Centrifuger minutes à g et à C Eliminer le surnageant Sécher le culot quelques minutes à C pour éliminer l ? éthanol Remettre le culot en suspension dans ??l d ? ED stérile FICHE TECHNIQUE ACTION DES ENZYMES DE RESTRICTION Protocole Dans un microtube mettre X ??l de la solution d ? ADN plasmidique X dépendant de la concentration en ADN de l ? extrait qui peut être évaluée par spectrophotométrie à nm gr? ce à la relation DO g d ? ADN diluer l ? ADN au ème dans l ? ED avant de lire la DO ??l du tampon de restriction ??l de chaque enzyme de restriction à U ??l QSP ??l ED stérile Mélanger brièvement Centrifuger à g quelques secondes Placer à l ? incubation H à C CFICHE TECHNIQUE ELECTROPHORESE D ? ACIDES NUCLEIQUES Principes généraux C ? est une technique de séparation des molécules chargées ici en fonction de leur taille Tous les fragments d ? ADN sont chargés négativement par perte de H en milieu tamponné basique L ? application d ? un champ électrique va les faire migrer vers le pôle positif de la cuve Les fragments vont se déplacer dans l ? épaisseur d ? un support dans ce cas un gel d ? agarose dont la maille est assez régulière et adaptée à la taille des fragments à séparer Cette migration sera facilitée d ? autant plus que la taille du fragment sera petite ce dernier migrera plus loin La lecture d ? un électrophorégramme nécessite une coloration ou une révélation Dans le cas présent la visualisation des fragments d ? ADN sur le gel nécessite la présence de bromure d ? éthidium agent intercalant de l ? ADN Fixée à la double hélice d