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Notes de travaux pratiques pdfdrive

CHIMIE THÉORIQUE ET PHYSIQUE APPLIQUÉE À L ? ANALYSE STRUCTURALE DES BIOMOLÉCULES CG Prof B Wathelet UNITÉ DE CHIMIE BIOLOGIQUE INDUSTRIELLE Prof M Paquot NOTES DE TRAVAUX PRATIQUES - Séances de laboratoire Dr A Richel Ir S Gillet - - CTechnique LC-MS Préparation des échantillons ? ??Echantillon solide inconnu par infusion directe Vous recevez solide que vous analyserez sous forme de pastille en IR et par infusion directe en MS Préparer une solution à d'acide formique HFo dans de l'eau milliQ attention HFo est très corrosif à préparer sous hotte Dans un eppendorf peser environ mg de votre produit et ajouter ml de la solution précédente Bien dissoudre votre produit à l'aide de l'agitateur à vortex Centrifuger le tube eppendorf minutes à tpm en veillant à équilibrer le rotor avec un autre eppendorf rempli de ml Prélever ml sans prélever au fond et transférer dans un nouvel eppendorf Analyser l'échantillon par infusion directe ? ??Echantillon de myoglobine Dans un eppendorf préparer une solution mère de myoglobine à mg par ml de l ? eau mQ Bien dissoudre votre produit à l'aide de l'agitateur à vortex Centrifuger le tube eppendorf minutes à tpm en veillant à équilibrer le rotor avec un autre eppendorf rempli de ml Prélever dans le surnageant pour les dilutions suivantes l de solution mère de myoblobine l d ? eau mQ avec de HFo attention HFo est très corrosif à préparer sous hotte l de solution mère de myoblobine l de formate d ? ammonium mM mg ml d ? H O mQ l de solution mère de myoblobine l de bicarbonate d ? ammonium mM mg ml d ? H O mQ Analyser les trois échantillons par infusion directe et comparer les résultats - - CNoyau hème avec O et histidine proximale C H N O Fe MMaver MMmonois Séquence de la myoglobine Myoglobine du muscle de cheval P MGLSDGEWQQ VLNVWGKVEA DIAGHGQEVL IRLFTGHPET LEKFDKFKHL KTEAEMKASE DLKKHGTVVL TALGGILKKK GHHEAELKPL AQSHATKHKI PIKYLEFISD AIIHVLHSKH PGDFGADAQG AMTKALELFR NDIAAKYKEL GFQG MM sans Met MMMet-H O ?? MM myoglobine avec hème - - C ? ??Etude en infusion et en LC-MS d ? un mélange de peptides Solution à g ml de chaque peptide dans l ? eau à d ? acide formique Gly-Tyr Val-Tyr-Val Tyr-Gly-Gly-Phe-Met Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Asp-Arg-Val-Tyr- Ile-His-Pro-Phe MM MM MM MM MM ? ??Hydrolyse trypsique de la myoglobine Préparation de l ? apomyoglobine La myoglobine est di ?cile à hydrolyser Pour faciliter son hydrolyse on enlève le noyau hème Elle devient de l ? apomyoglobine ?? Préparer une solution de myoglobine à environ ?? Ajuster le pH à par ajout de HCl N à C ?? Ajouter un volume égal de -butanone ?? Agiter minutes à C ?? Laisser reposer minutes ?? Enlever la couche de -butanone qui contient le hème ?? Encore répéter fois l ? extraction à la -butanone ?? Lyophiliser la phase aqueuse Hydrolyse trypsique Cterm Arg et Lys ?? dans un eppendorf peser environ mg d ? apomyoglobine nmol ?? ajouter l de solution de trypsine