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Southern blot Intro Les blots en général se sont des techniques de transfert d'ADN d'ARN et de protéines sur un support de sorte qu'ils peuvent être séparé Par exemple southern blot La dé ?nition Southern blot un méthode de biologie moléculaire a été init

Intro Les blots en général se sont des techniques de transfert d'ADN d'ARN et de protéines sur un support de sorte qu'ils peuvent être séparé Par exemple southern blot La dé ?nition Southern blot un méthode de biologie moléculaire a été initialement décrite par E M Southern en Elle consiste à détecter spéci ?quement des fragments d'ADN transférés sur ?ltre par leur hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radioisotope Le but de southern blot permet de localiser une séquence d ? ADN parmi les fragments ayant migrés gr? ce à une sonde marquée Elle permet de détecter une séquence d'ADN génomique dite unique le principe Nous partons des fragments d'ADN obtenus par les enzymes de restriction On va appliquer la technique du transfert de Southern pour ?xer les sondes aux fragments leur correspondant une sonde étant un fragment d'ADN auquel on a marqué une base gr? ce à des composés radioactifs uorescents ou un anticorps qui sert à localiser une séquence de l'ADN qui nous intéresse Le transfert de Southern sert donc à repérer des fragments d'ADN D'une façon plus générale ces fragments obtenus vont présenter des polymorphismes de restriction Un polymorphisme de restriction est une variation individuelle de la séquence des bases du génome des eucaryotes modi ?ant un ou plusieurs sites de restriction Donc Cces polymorphismes de restriction mutations vont dans les faits être intéressants pour déterminer des variations géniques des tests de paternité par exemple Le principe La clé de ce procédé est l'hybridation Hybridation Il est le processus de formation d'une molécule d'ADN double brin entre une sonde d'ADN simple brin et un ADN cible simple brin Le protocole Extraction de l ? ADN Restriction de l ? ADN l ? électrophorése Transfert Hybridation Autoradiographi Méthode ADN génomique est d ? abord fragmenté par une enzyme de restriction appropriée Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d ? agarose L ? ADN est dénaturé in situ par une solution de soude L ? ADN dénaturé simple brin est transféré par capillarité sur un support solide ?ltre de nitrocellulose ou nylon Les membranes de nylon sont les plus utilisées car par un Ctraitement au UV nm on forme des liaisons covalentes entre le DNA et le nylon de sorte que le support peut être utilisé plusieurs fois avec d ? autres sondes Le support solide est hybridé avec une sonde mono-brin marquée à faible stringence puis lavé Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par la technique de l ? autoradiographie Résultat La sonde va révéler la position sur la membrane des fragments d'ADN recherchés Plusieurs situations peuvent se présenter Les fragments d'ADN sont semblables au lieu d'hybridation de la sonde et à proximité de celui-ci et les fragments sont de même taille il n'y a pas de polymorphisme C Un site de restriction au voisinage de la sonde n'est présent que chez l'un des deux individus les fragments n'ont pas la même taille et ne sont donc pas à