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M ME ET TH HO OD DE E O OF FF FI IC CI IE EL LL LE E D D’ ’A AN NA AL LY YS SE

M ME ET TH HO OD DE E O OF FF FI IC CI IE EL LL LE E D D’ ’A AN NA AL LY YS SE E TECHNIQUES ELISA Bactériologie/Virologie Réf. : MOA 008 version 1a M ME ET TH HO OD DE E O OF FF FI IC CI IE EL LL LE E D D’ ’A AN NA AL LY YS SE E. . M MO OA A0 00 08 8 v ve er rs si io on n 1 1a a T Te ec ch hn ni iq qu ue es s E EL LI IS SA A B Ba ac ct té ér ri io ol lo og gi ie e/ /V Vi ir ro ol lo og gi ie e t te ec ch hn ni iq qu ue e E EL LI IS SA A P Pa ag ge e 2 2 s su ur r 2 2 Droits de reproduction et Copyright Le présent document est, sous sa forme électronique, mis gratuitement à la disposition des usagers du ministère chargé de l’agriculture en tant que méthode. Le présent document est la propriété du ministère chargé de l’Agriculture, toute reproduction qu’elle soit totale ou partielle ne peut être effectuée qu’à la condition expresse que la source soit citée. Dates de validité du présent document Le présent document a valeur de méthode officielle à compter de sa date de publication indiquée ci-après. Il remplace alors de facto toute version antérieure. Cependant, et sauf indication contraire explicite, la version précédente peut encore être utilisée pendant une durée maximale de 18 mois à compter de la date de publication de la nouvelle version, afin de tenir compte des cycles d’accréditation auxquels sont soumis les laboratoires de référence, agréés et reconnus officiellement. Ce document étant susceptible d’évolution, il est de la responsabilité exclusive des utilisateurs de vérifier régulièrement qu’ils disposent bien de la dernière version. Le tableau ci-dessous récapitule l’historique de la méthode. MOA 008 Consultation publique Validité Numéro de la version Début Fin Début Fin DG01/98a - - 1998 Juin 2005 DG01/98b - - Juin 2005 Janvier 20111 MOA 008 version 1a Avril 2010 Septembre 2010 Octobre 2010 1 Les antisera étant des réactifs critiques dont la qualité doit être contrôlée pour assurer la qualité des analyses, la durée de validité de l’ancienne méthode officielle (DG01/98b) est raccourcie et portée à 3 mois. M ME ET TH HO OD DE E O OF FF FI IC CI IE EL LL LE E D D’ ’A AN NA AL LY YS SE E. . M MO OA A0 00 08 8 v ve er rs si io on n 1 1a a T Te ec ch hn ni iq qu ue es s E EL LI IS SA A B Ba ac ct té ér ri io ol lo og gi ie e/ /V Vi ir ro ol lo og gi ie e t te ec ch hn ni iq qu ue e E EL LI IS SA A P Pa ag ge e 3 3 s su ur r 3 3 SOMMAIRE PREAMBULE ................................................................................................................................5 Objet des méthodes officielles .........................................................................................................5 Glossaire, abréviations et documents connexes .................................................................................5 Limites imposées aux laboratoires agréés ou reconnus.......................................................................5 Échantillonnage et échantillon .........................................................................................................5 Modification des méthodes officielles ..............................................................................................5 Considérations d’ordre métrologique................................................................................................6 Obligations réglementaires et limites de responsabilité......................................................................6 Revue des méthodes officielles, amendement et modification ............................................................7 ORIGINE DE LA METHODE.....................................................................................................7 PRINCIPALES MODIFICATIONS PAR RAPPORT A LA VERSION PRECEDENTE.....8 Modifications ...............................................................................................................................8 Améliorations...............................................................................................................................8 DESCRIPTION DE LA METHODE ...........................................................................................9 1. Objet.....................................................................................................................................9 2. Domaine d’application. ........................................................................................................9 3. Présentation schématique de la détection...........................................................................10 4. Produits et consommables..................................................................................................11 4.1. Les antisera.................................................................................................................11 4.1.1. Choix du fournisseur par le laboratoire utilisateur.............................................11 4.1.2. Contrôles effectués par le laboratoire utilisateur................................................12 4.2. Tampons.....................................................................................................................13 4.3. Plaques de microtitration............................................................................................13 4.4. Substrat de l’enzyme ..................................................................................................13 4.5. Autres consommables ................................................................................................13 5. Appareillage et matériel .....................................................................................................13 5.1. Petit matériel : ............................................................................................................13 5.2. Gros matériel :............................................................................................................14 6. Contrôles et témoins (références de lecture)......................................................................14 6.1. Référence de lecture de l’absorbance (puits substrat)................................................14 6.2. Contrôle positif (témoin malade : TM) ......................................................................15 6.3. Contrôle négatif (témoin sain : TS)............................................................................15 6.4. Référence tampon d'extraction (Tp)...........................................................................16 7. Etapes de l’analyse.............................................................................................................16 7.1. Plan de plaque ............................................................................................................16 7.2. Dépôt des anticorps de capture (coating) ...................................................................16 M ME ET TH HO OD DE E O OF FF FI IC CI IE EL LL LE E D D’ ’A AN NA AL LY YS SE E. . M MO OA A0 00 08 8 v ve er rs si io on n 1 1a a T Te ec ch hn ni iq qu ue es s E EL LI IS SA A B Ba ac ct té ér ri io ol lo og gi ie e/ /V Vi ir ro ol lo og gi ie e t te ec ch hn ni iq qu ue e E EL LI IS SA A P Pa ag ge e 4 4 s su ur r 4 4 7.2.1. Dépôt ..................................................................................................................16 7.2.2. Incubation...........................................................................................................17 7.2.3. Lavage(s)............................................................................................................17 7.3. Dépôt des extraits.......................................................................................................18 7.3.1. Dépôt ..................................................................................................................18 7.3.2. Incubation...........................................................................................................18 7.3.3. Lavage(s)............................................................................................................18 7.4. Dépôt des anticorps conjugués...................................................................................18 7.4.1. Dépôt ..................................................................................................................18 7.4.2. Incubation...........................................................................................................19 7.4.3. Lavage(s)............................................................................................................19 7.5. Dépôt du substrat........................................................................................................19 7.5.1. Dépôt ..................................................................................................................19 7.5.2. Incubation...........................................................................................................19 7.6. Autres étapes éventuelles complémentaires...............................................................19 8. Résultats .............................................................................................................................20 8.1. Validation des résultats ..............................................................................................20 8.1.1. Lecture des plaques de microtitration ................................................................20 8.1.2. Vérification de l’interprétabilité des résultats avant exploitation des valeurs d’absorbance.......................................................................................................................20 8.2. Interprétation et formulation des résultats..................................................................21 8.2.1. Critères d’interprétation des lectures : détermination de seuils .........................21 8.2.2. Détermination et formulation du résultat d'analyse............................................23 9. Elimination des matériels susceptibles d’être contaminants..............................................24 10. Conservation des reliquats de matériels utilisés.............................................................24 LISTE DES DOCUMENTS OFFICIELS APPELES PAR LA METHODE.........................25 REMERCIEMENTS....................................................................................................................25 BIBLIOGRAPHIE SUCCINCTE ..............................................................................................26 ANNEXE I. Exemple de plan de plaque ...................................................................................28 ANNEXE II – Tableau de correspondance................................................................................29 M ME ET TH HO OD DE E O OF FF FI IC CI IE EL LL LE E D D’ ’A AN NA AL LY YS SE E. . M MO OA A0 00 08 8 v ve er rs si io on n 1 1a a T Te ec ch hn ni iq qu ue es s E EL LI IS SA A B Ba ac ct té ér ri io ol lo og gi ie e/ /V Vi ir ro ol lo og gi ie e t te ec ch hn ni iq qu ue e E EL LI IS SA A P Pa ag ge e 5 5 s su ur r 5 5 P PR RE EA AM MB BU UL LE E O OB BJ JE ET T D DE ES S M ME ET TH HO OD DE ES S O OF FF FI IC CI IE EL LL LE ES S Les méthodes officielles, au sens du décret 2006-7 du 4 Janvier 2006, sont les méthodes validées par le ministère chargé de l’agriculture pour l’utilisation dans le cadre des actes officiels relevant de ses services (plans de contrôle et de surveillance, contrôles à l’importation et à l’exportation…). Ces méthodes concernent le diagnostic, la détection ou l’identification d’organismes nuisibles aux cultures, d’organismes envahissants ou d’organismes génétiquement modifiés pour le domaine d’application précisé dans la méthode. Ces méthodes servent de « méthodes publiées » au sens de la norme ISO 17025 pour l’accréditation des laboratoires par le COFRAC. G GL LO OS SS SA AI IR RE E, , A AB BR RE EV VI IA AT TI IO ON NS S E ET T D DO OC CU UM ME EN NT TS S C CO ON NN NE EX XE ES S Afin de limiter les problèmes d’interprétation des termes employés, le vocabulaire utilisé dans les méthodes officielles du ministère chargé de l’agriculture est issu des normes, guides ou glossaires nationaux ou internationaux appropriés (AFNOR, ISO, CIPV, OEPP…). Le glossaire GLO-001 reprend les principales définitions. L’attention des lecteurs est attirée sur le fait que les termes intégrés au glossaire ne sont, en règle générale, pas spécifiquement repérés dans le corps des méthodes officielles. Certains documents (composition de milieux et tampons…) peuvent être communs à plusieurs méthodes officielles. Pour faciliter leur harmonisation et leur mise à jour, ils sont rassemblés dans des recueils spécifiques, considérés comme faisant partie intégrante des méthodes officielles. Les méthodes officielles appellent alors ces documents spécifiques en donnant leur code tel que repris dans les recueils. L LI IM MI IT TE ES S I IM MP PO OS SE EE ES S A AU UX X L LA AB BO OR RA AT TO OI IR RE ES S A AG GR RE EE ES S O OU U R RE EC CO ON NN NU US S Le ministère chargé de l’agriculture peut proposer ou imposer aux laboratoires, agréés ou reconnus, de stopper l’analyse à une certaine étape précisée dans la méthode officielle et, le cas échéant, de transmettre le matériel nécessaire à la poursuite de l’analyse dans un autre laboratoire, agréé ou de référence. Il est de la responsabilité de chaque laboratoire de veiller à suivre les contraintes définies par son périmètre d’agrément ou de reconnaissance et uploads/s1/elisa.pdf