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Nom : Module : Mycologie Appliquée Prénom : TP02 : PURIFICATION ET AIDENTIFICAT

Nom : Module : Mycologie Appliquée Prénom : TP02 : PURIFICATION ET AIDENTIFICATION DES CHAMPIGNONS Groupe : NOTE OBSERVATION INTRODUCTION : De nombreux micromycètes puisent leurs aliments carbonés sur des êtres vivants: ils sont parasites. Ils vivent aux dépens de végétaux ou d'animaux et peuvent provoquer chez l'hôte des dommages parfois graves. Pour identifier et limiter les effets nuisibls de ces champignons et pouvoir les éliminer biologiquement par phénomène d’antagonisme il faut tout une étude in vitro en passant par des étapes d’isolement, de purification et d’observations macro et microscopique. BUT : Purification et identification des micromycètesà partir d’échantillons de sol et de feuilles de vigne infectées en se basant sur l’aspect micro et macroscopique. PRINCIPE : Pour la purification, l’opération consiste à avoir une culture pure par repiquage d’une colonie isolée ; d’abord on doit prélever les mycéliums qui émergent aux bords de thalle à repiquer et les transférer par une anse de platine stérile par piqure centrale sur le milieu PDA, puis incubation à 30 ̊C. Le processus de purification permet d'obtenir pour chaque micro-organisme différent des colonies distinctes. Enfin l’identification des champignons en observant l’aspect macroscopique à l’œil nu et microscopique en suivant des méthodes bien spécifiques au caractère de mycélium tout en notant la morphologie des colonies fongiques et leurs caractères culturaux. Milieu PDA : La gélose à l’extrait de pomme de terre est utilisée pour l’isolement, la culture, et le dénombrement des levures et des moisissures dans les produits alimentaires, cosmétiques et pharmaceutique. La teneur en glucose et en amidon favorise la culture des levures et des moisissures tandis que le pH acide inhibe la plus part des bactéries. RESULTATS ET DISCUSSION : Aspect macroscopique de repiquage sur milieu PDA d’une colonie de champignons prélevé de la culture de sol Après purification sur milieu PDA de quelques spores de l’échantillon on procède à : 1-Une i dentification macroscopiques : Pour l’observation macroscopique des moisissures, il est nécessaire de caractérisé ces isolats par : L’aspect des colonies : qui représente un critère clef d’identification. Les champignons filamenteux forment des colonies duveteuses, laineuses, cotonneuses, veloutées, poudreuses ou granuleuses. La couleur des colonies : c’est un élément très important d’identification. Les couleurs les plus fréquentes sont le blanc, crème, jaune, orange, brun allant jusqu’au noir. Les pigments peuvent être localisés au niveau du mycélium (Aspergillus, Penicillium) ou diffuser dans le milieu de culture. *Donc on remarque un développement rapide de l’isolat fongique,la présence de plusieurs colonies Veloutéesde couleur verte avec un contour blanc irrégulier, le revers est incoloret il y’a une forte odeur de moisi. 2-Une étude microscopique : porte sur l’observation des structures caractéristiques de la souche fongique étudier (Conidiophores, conidies, mycélium…). La détermination des moisissures fait appel aux caractères morphologiques des hyphes et des structures de reproduction. Les hyphes : couleur, présence ou non de cloisons, diamètre approximatif, structures particulières (corémies,...). Organes de reproduction (1 ou plusieurs types) : localisation (partie aérienne, ...), couleur, taille et forme des organes de reproduction. Structure et disposition des spores : couleur, forme, cloisons, ornementation, taille ... Les études microscopiques sont faites à partir d'un échantillon monté entre lame et lamelle dans une goutte d'eau ou de colorant. Si :  Le mycéliumaérienestabondant -Prélever un minimum de mycélium et le déposer sur lame dans une goutte de Lactophénol d’Amann, recouvrird’unelamelle et observer. -Si non on utilise la méthode de Ruban adhésif : Un petit morceau du ruban adhésif est appliqué par la face collante sur la colonie puis déposé sur une lame porte-objet.  Le mycelium estras -Découper un carré de gélose d’environ 3 mm de côté, soit vers les marges soit à une distance entre le point d’inoculum et la marge. -Emporter le minimum de gélose et déposer le prélèvement sur une lame dans une goutte de lactophénol. -Chauffer avec précaution la lame au-dessus de la veilleuse d’un bec Bunsen en la remuant doucement jusqu’à l’apparition de vapeurs. -Une fois la gélose fondue, ajouter une goutte de Lactophénol d’Amann et recouvrir d’une lamelle. Le lactophénol d'Amann donne de très bons résultats. Il ne provoque ni contraction, ni gonflement des cellules ; peu volatil, il permet une bonne conservation des préparations. D’après la technique de ruban adhésif on a pu observer des spores dispersées ou assemblées de couleur vert. La technique de coloration de lactophénol bleu à permet d’observer des conidiophores isolés, des pénicilles constitués de phialides branchés directement à l’extrémité des conidiophores qui apparaissent tous colorés en bleu.le mycélium est septé conidiophore est septé, possèdent une forme ressemblant à celle d’un pinceau et porte des phialides, Les conidies produites par les phialidessont ellipsoïdales à subglobuleuses, lisses, et forment de longues chaînes irrégulières et parfois elles sont ortées par des métules---penicillium sp L’identification préliminaire de l’isolat obtenu basé sur l’étude macroscopique et microscopique, a révélé qu’il s’agit de Penicillium chrysogenum CONCLUSION : Avant d’entamer l’identification, on procède à la purification des souches isolées à l’aide d’une série de repiquage qui consiste à transférer aseptiquement un microorganisme dans un milieu neuf et stérile pour le maintenir en culture pure. Cette opération a pour but de faciliter l’identification des champignons. L’identification reste l’opération la plus difficile dans le domaine de la mycologie, elle a pour but de classer les souches fongiques par genres et espèces selon les critères d’identification. Elle est basée sur les deux aspects : microscopiques et macroscopiques. uploads/s3/ tp-microbiologie.pdf