Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

Bioprocess Biosyst Eng DOI 10.1007/s00449-016-1548-2 PAPIER ORIGINAL Caractéris

Bioprocess Biosyst Eng DOI 10.1007/s00449-016-1548-2 PAPIER ORIGINAL Caractérisation des propriétés biochimiques du Xyn10C recombinant issu d'une bactérie marine,Saccharophage dégradant 2-40 Ja Kyong Ko1 • Hyeokjin Ko2 • Kyoung Heon Kim2 • In-Geol Choi2 Reçu : 30 juin 2015 / Accepté : 8 janvier 2016 - Springer Verlag Berlin Heidelberg 2016 RésuméEndo-1,4-b-les xylanases sont principalement classées dans la famille 10 ou 11 des glycosides hydrolases (GH). Dans cette étude, nous avons examiné les fonctions catalytiques d'une endo-1,4- recombinante.b-xylanase appartenant à GH10 (Xyn10C) issue d'une bactérie marine,Saccharophage dégradant2-40. L'activité optimale de cette enzyme était évidente à 30 °C et pH 7,0, mais l'activité est restée même à basse température, indiquant son adaptation au froid. Par rapport aux autres xylanases connues pour être actives à des températures froides, Xyn10C est unique en ce qu'elle a montré une activité maximale en présence de 2 M de NaCl. Les schémas d'action du Xyn10C recombinant sur les xylanes de feuillus et de résineux différaient en partie, mais l'enzyme hydrolysait les substrats polysaccharidiques principalement en xylobiose et xylotriose via des xylooligosaccharides, libérant une petite quantité de xylose. La KmetVmaximumles valeurs sur le xylane de bouleau étaient de 10,4 mg mL-1et 253jemole mg-1min-1, respectivement. La fonction catalytique efficace de Xyn10C sur les chaînes de xylo-oligosaccharides de courte longueur était similaire à la fonction typique d'autres xylanases GH10 connues. Mots clésXylanase adaptée au froid - Endo-1,4-b- xylanohydrolase - Xyn10C -Saccharophage dégradant 2-40 - GH10 Introduction La lignocellulose, un complexe de cellulose, d'hémicellulose et de lignine, est considérée comme l'un des types de biomasse les plus courants.1–3]. Le xylane, qui est le constituant majeur de l'hémicellulose, est un polymère hétérologue composé d'un squelette d'unités xylopyranose substituées par divers groupements, dontO-acétyl-4-O-méthyle-ré -glucuronopyranosyle etL-résidus arabinofuranosyl, selon son origine [4]. L'hydrolyse du xylane est catalysée par diverses xylanases, y compris les xylanases de type endo et exo et la xylosidase.4,5]. Endo-1,4-b-xylanohydrolase (EC 3.2.1.8) attaque de manière aléatoire les liaisons glycosidiques du squelette xylane, réduisant ainsi le degré de polymérisation [4,5]. Selon la base de données CAZy (http://www.cazy.org) et les similitudes de séquence des domaines catalytiques, endo-1,4-b-les xylanases appartiennent principalement à la famille des glycosides hydrolases (GH) 10 ou 11 [6,sept]. Alors que GH10 a un (un B)8 pli en barillet et a généralement une masse moléculaire supérieure à 30 kDa, ainsi qu'un faible pI, GH11 a unb-structure jelly roll, une masse moléculaire inférieure à 30 kDa, et un pI élevé [5,6]. Tous les membres de la famille GH10 sont classés en endo-1,4-b-xylanases (EC 3.2.1.8) et endo-1,3-b-xylanases (EC 3.2.1.32), ayant un site de liaison au substrat plus petit et une plus grande affinité pour les chaînes oligosaccharidiques courtes que les membres de la famille GH11 [5,6]. Jusqu'à présent, les xylanases ont été étudiées principalement dans les champignons ou les bactéries lignivores, y comprisTrichoderma, Aspergillus, Pénicillium,etStreptomycesespèces [4,8,9]. Matériel supplémentaire électroniqueLa version en ligne de cet article (doi :10.1007/s00449-016-1548-2) contient des éléments supplémentaires, qui sont mis à la disposition des utilisateurs autorisés. &Kyoung Heon Kim khekim@korea.ac.kr &In-Geol Choi igchoi@korea.ac.kr Ja Kyong Ko kodalki@gmail.com 1 Clean Energy Research Center, Korea Institute of Science and Technology, Séoul 136-791, République de Corée 2 Department of Biotechnology, Korea University Graduate School, Seoul 136-713, République de Corée 123 Traduit de Anglais vers Français - www.onlinedoctranslator.com Bioprocess Biosyst Eng Récemment, cependant, les xylanases de micro-organismes marins ont reçu plus d'attention en raison de leurs propriétés physiologiques uniques et polyvalentes, dont l'une est la capacité de s'adapter à la salinité et aux basses températures communes aux environnements marins difficiles.9]. Les études concernant le clonage et la caractérisation de nouvelles xylanases actives à froid provenant de sources inhabituelles se sont principalement concentrées sur les xylanases de la famille GH8, telles que les endoglucanases (EC 3.2.1.4), les lichenases (EC 3.2.1.73) et les chitosanases (EC 3.2.1.132), représentant des fonctions moléculaires hétérogènes [5, dix,11]. Une bactérie marine,Saccharophage dégradant2-40, est considéré comme l'organisme ultime de dégradation des polysaccharides car il peut dégrader une large gamme de polysaccharides complexes de la paroi cellulaire [12–14]. Le génome complet deS. degradans2-40 a été récemment séquencé et de nombreux gènes ont été annotés comme cellulases, xylanases et agarases [15]. Cependant, seuls quelques-uns de ces gènes ont été examinés pour déterminer leurs fonctions moléculaires détaillées ou ont été vérifiés par clonage, expression ou caractérisation enzymatique.14,16–20]. Dans un rapport préliminaire, la surexpression de xyn10Cisolé deS. degradans2-40 poEscherichia coliBL21 (DE3) a été un succès et les conditions de fermentation ont également été optimisées dans les flacons agités et les échelles de fermenteur [21]. Cependant, nous avons mené d'autres études pour identifier les fonctions moléculaires du Xyn10C recombinant purifié et son analyse de séquence. Il s'agit du premier article à présenter une caractérisation complète d'une xylanase de type endoS. degradans2-40. une analyse [15]. Le gène a été amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir de l'ADN génomique deS. degradans 2-40 (xyn10c-N : 50-GTGAATTGTACGCGTAGGAAT ATA-30; xyn10c-C : 50 -CAACTTGAGGGCCACTAAG G-30) Les conditions de PCR étaient les suivantes : 95 -C pendant 30 s, suivi de 30 cycles de 95 -C pendant 20 s, 55 -C pendant 20 s, 72 -C pendant 60 s, et une extension finale à 72 -C pendant 10 minutes. Le fragment amplifié résultant a ensuite été inséré dans un vecteur pET21a modifié (Novagen, Madison, WI, USA) qui avait six résidus d'histidine supplémentaires attachés à l'extrémité C-terminale de la protéine et transformé enE. coli DH5a pour le séquençage.E. coliDH5a etE. coliBL21(DE3) ont été utilisés pour le clonage et l'expression des gènes, respectivement. Le programme ClustalW a été utilisé pour aligner la séquence d'acides aminés déduite de Xyn10C avec des séquences similaires obtenues à partir des recherches de l'outil de recherche d'alignement local basique (BLAST) de la base de données GenBank [22,23]. Purification de Xyn10C recombinant Le recombinantE. coliBL21(DE3) hébergeantxyn10C a été cultivée à une densité optique de 0,8 à 600 nm dans 100 ml de milieu LB additionné de 50jeg/mL d'ampicilline (Sigma–Aldrich) à 37 °C et 250 tr/min. L'organisme a ensuite été incubé pendant une nuit avec 0,1 mM d'isopropyleb-ré-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 16 °C et 180 tr/min pour induire l'expression dexyn10C. Les cellules ont été récoltées à partir de la culture par centrifugation à 3000gpendant 20 min et remis en suspension dans du tampon de lyse. Pour obtenir des protéines solubles, les cellules ont été perturbées par sonication (processeur à ultrasons Sonics-Vibra cell) sur de la glace pendant 10 min (amplitude de 35 %, impulsion de 1 s et impulsion de 5 s). Le surnageant résultant a ensuite été chargé sur une colonne His- Trap SP (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) dans 50 mM de solution tampon de phosphate de sodium (pH 7,4), et la protéine cible a été éluée à l'aide de 300 mM de solution d'imidazole. Ensuite, les fractions contenant l'enzyme purifiée ont été échangées avec un tampon dans 20 mM de phosphate de sodium (pH 7,4) à l'aide d'un filtre ultra centrifuge Amicon avec une taille d'exclusion de 10 kDa (Millipore, Bedford, MA, USA). La fraction soluble de la xylanase recombinante brute et purifiée a ensuite été analysée par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium à 8 % (p/p) de polyacrylamide (SDS- PAGE) et colorée avec du bleu brillant de Coomassie R-250 (Bio- Rad, Hercules, CA , ETATS-UNIS). La détermination de la concentration en protéines a été effectuée à l'aide d'un kit d'analyse de protéines BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). matériaux et méthodes Microorganisme et conditions de croissance Saccharophage dégradant2-40 (ATCC 43961) a été cultivé à 27 -C pendant 24 h dans un milieu minimal contenant 23 g L -1de sels Instant Ocean Sea (Aquarium Systems, Mentor, OH, USA), 1 g L-1d'extrait de levure, 50 mM de tampon Tris–HCl (pH 7,4) et 0,05 % (p/v) de chlorure d'ammonium additionné de 0,2 % (p/v) de xylane de bouleau (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) comme source de carbone. E. coliBL21(DE3) a été cultivé dans du milieu Luria- Bertani (LB) (BD, Franklin Lakes, NJ, USA), composé de 10 g L-1de tryptone, 5 g L-1d'extrait de levure, 10 g L-1 de NaCl, et 50jegmL-1d'ampicilline (Sigma-Aldrich). Clonage du gène xyn10C deS. degradans2-40 et analyse de séquence Dosage enzymatique et paramètres cinétiques Un essai d'activité de xylanase a été effectué en utilisant une solution de xylane de bouleau à 1 % (p/v) comme substrat. Le sucre réducteur libéré par la réaction enzymatique a été quantifié avec Nous avons sélectionné un gène potentiel de xylanase,xyn10C (ID d'entrée UniProt : Q21HD6), basé sur l'annotation et le domaine 123 Bioprocess Biosyst Eng réactif acide dinitrosalicylique utilisant du xylose comme sucre réducteur standard [24]. Le mélange de dosage total, 100jeL, composé de 90jeL de solution de xylane et 10jeL de xylanase convenablement diluée a été incubée à 30 °C et pH 7,0 pendant 10 min. Une unité d'activité enzymatique a été définie comme 1 jemole d'équivalent xylose produit par minute par quantité d'enzyme dans les conditions de réaction ci-dessus. Xylane de bouleau à des concentrations variant de 4 à 50 mg mL-1a été utilisé comme substrat pour la détermination des constantes cinétiques. Les paramètres des facteurs cinétiques enzymatiques tels que la constante de Michaelis – Menten (Km) uploads/Finance/ caracterisation-des-proprietes-biochimiques-du-xyn10c-recombinant-issu-d-x27-une-bacterie-marine-saccharophage-degradant-2-40 1 .pdf