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Cytogénétique Moléculaire Pr Ahmed Bouhouche Introduction Le caryotype est l'ex

Cytogénétique Moléculaire Pr Ahmed Bouhouche Introduction Le caryotype est l'examen génétique le plus prescrit, car il permet une analyse globale du génome. Il permet de détecter 15% des anomalies. Mais il possède un faible niveau de résolution : - caryotype classique : 400 bandes = 5-10 Mb / bande Il met en évidence des anomalies de nombre, et de structure de taille suffisante. Limites : - impossibilité de caractériser finement un remaniement visible (résolution) - les remaniements cryptiques ne sont pas visibles - impossible à réaliser en l'absence de mitose La cytogénétique moléculaire permet d'augmenter ce niveau de résolution. Introduction Limites de la cytogénétique conventionnelle: - obtention de métaphases - résolution : 5 – 10 Mb Intérêt de la Cytogénétique Moléculaire…. Caryotype = Examen de 1ère intention Introduction Cytogénétique conventionnelle Biologie moléculaire Cytogénétique moléculaire La Cytogénétique Moléculaire Les différentes techniques: v FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence) • Principe • Avantages et inconvénients v CGH (Hybridation Génomique Comparative) • Principe • Sensibilité v FISH et CGH : Limites des techniques v Puces à ADN • Définitions • Différents types de puces • CGH-array • Puces à SNP • Intérêts, applications, inconvénients FISH et CGH • Hybridation in situ fluorescente : FISH • Fragments d ’ADN marqués par un fluorochrome = Sonde => Fixation de la sonde par complémentarité Les sondes sont marquées soit avec une molécule fluorescente, soit avec un haptène (molécule qui peut être reconnue par un anticorps). => Au microscope on repère la présence ou l ’absence de la sonde utilisée et le nombre d ’exemplaire Cette sonde est mise en contact avec les chromosomes d'une mitose (ou de noyaux interphasiques) et va s'hybrider (se fixer) spécifiquement au niveau de sa séquence complémentaire. On peut alors visualiser la sonde au microscope dont l'emplacement identifie précisément la région chromosomique dont elle est complémentaire. • Cette technique peut être appliquée sur des métaphases ou directement sur des noyaux en interphase FISH : Principe -Le principe de la technique d’hybridation in situ en fluorescence avec des sondes froides (FISH) est basé sur le fait que l’ADN est une molécule double hélice formée de deux brins complémentaires. -Ces deux brins peuvent être séparés par la chaleur et / ou par un traitement acide ou alcalin I = ETAPE DE DENATURATION -Une sonde d’acide nucléique contenant une séquence complémentaire au simple brin d’ADN, peut alors former un hybride spécifique avec l’ADN simple brin II = ETAPE D’HYBRIDATION -Cette sonde est marquée directement ou indirectement avec un ou plusieurs fluorochromes, l’hybridation des séquences nucléiques complémentaires peut être visualisée en fluorescence après contre coloration du support (chromosomes ou noyaux) III = ETAPE DE REVELATION FISH : La procédure FISH : La procédure CIBLE SONDE ADN double brin (mitoses ou noyaux interphasiques) ADN double brin marqué T A A G G A T A A T T C C T A T Dénaturation thermique Hybridation complémentaire 37°C O/N FISH : La procédure Lavages Elimination des sondes non spécifiquement fixées La sonde moléculaire se fixe sur sa cible Pas de sonde fixée = délétion Analyse au microscope en épifluorescence (filtres adaptés aux différents fluorochromes) Microdélétions Anomalies de structure Identification de marqueurs Analyse d’un grand nombre de cellules en évitant l’étape de culture (aneuploïdies) Remaniements géniques acquis Clone acquis minoritaire anormal Anomalie de structure d’1 chromosome Analyse d’un caryotype complexe FISH Interphasique (Nx interphasiques) FISH Métaphasique (métaphases 1 ou 2 chromosomes) Multiplex-FISH et SKY (métaphases - panchromosomique) - Cible : Chromosomes ou Nx interphasiques - Sonde(s) d’acide nucléique complémentaire(s) d’une séquence donnée mBand FISH (étude du banding d’un chromosome ) →Résultat rendu en % de noyaux →Résultat rendu sur chromosomes →Résultat rendu sur chromosomes →Résultat rendu sur chromosomes FISH : Différents types de sondes FISH : Différents types de sondes Loci spécifiques Sondes de BACs RP11-335E8 2p12 RP11-356H17 2p13.3 Sondes sub-télomériques Peintures chromosomiques Sondes centromériques M-FISH Exemple de microdélétion au niveau du chromosome 15q détectée par l’utilisation de sonde à locus spécifique ●Confirmation d’anomalies suspectées par le caryotype ●Précision de points de cassure ●Détection des aneuploïdies ●Détermination du sexe ●Microdélétions ●Suivi de traitements, recherche de maladie résiduelle ●Suivi d’allogreffe de moelle FISH : Applications FISH : Avantages et Inconvénients Avantages v Technique sensible (noyaux et métaphases) v Grand choix de sondes (commerciales ou « maison ») Inconvénients v Technique lourde nécessitant des traitements différents selon la nature de l’échantillon à analyser (métaphases, noyaux, tissus) v Analyse ciblée : Nécessité d’avoir une idée préalable de la région chromosomique ou du gène à étudier v 3 cibles maximum par test Comparative Genomic Hybridization : Principe ADN à tester Co-hybridation ADN de référence nb copies ADN test > nb copies ADN de référence => amplification nb copies ADN de référence > nb copies ADN test => délétion Nécessité d’une culture cellulaire FISH et CGH : Limites des techniques FISH Etude ciblée Résolution = 100-300Kb Caryotype CGH Analyse globale du génome Résolution = 5-10 Mb v La FISH reste encore utilisée en routine pour des maladies particulières v La CGH est peu utilisé actuellement et a été remplacé par les puces à ADN Puces à ADN PUCES A ADN : Différents types Il existe deux types de technologies : v CGH-array proprement dite (hybridation génomique comparative par rapport à un ADN de référence) ; résolution limitée (50-200Kb) v Puces à SNP ne nécessitant pas d’ADN de référence (Illumina, Affymetrix) : haute résolution (oligonucléotides de 25 à 80-mer) + recherche de régions de perte d’hétérozygotie + Mosaïcisme CGH-array : Principe v Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN) v Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN test et témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci spécifiques présents sur un support solide (lame de verre) v Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci spécifiques et connus sur un génome entier ADN test marqué en CYA3 ADN de référence marqué en CYA5 Dénaturation et hybridation sur puce à ADN Loci spécifiques (BAC / PAC / oligonucléotides de synthèse) SCANNER Défaut d’ADN test Excès d’ADN test Lame de verre CGH-array : Principe CGH-array : Analyse des résultats Ex : BAC-array / Array-300 Abbott® Cy3 (ADN Test) Cy5 (ADN Référence) ratio T/R calculé 3 spots / clone • 0.8 < T/R < 1.2 => pas de déséquilibre • T/R < 0,8 => délétion • T/R > 1,2 => amplification v Résultats d’analyse sur puce IntegraGen® CGH-array: Exemple d’application Duplication d’une région chromosomique Puces à SNP: Principe Chaque marqueur est un oligonucléotide correspondant à un SNP ……..ATGC……… ……..ATAC……… Allele A Allele B Le polymorphisme ponctuel (SNP) : 15 Millions de SNP identifiés 90% du polymorphisme humain Grandes fréquences Répartition homogène dans le génome Régions codantes, Nc ou régulatrices Parfois conséquences fonctionnelles Puces Affymertix Génotypage de millions de SNP à moindre coût Puces à SNP: Principe Puces à SNP: Principe v Les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur la puce v Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN) v L’ADN à tester s’hybride avec sa séquence complémentaire fixée sur la puce v Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau des marqueurs spécifiques et connus sur un génome entier v Identification de pertes d’hétérozygotie (LOH) Plateforme Affymetrix Array Station de lavage et Scanner Four d’hybridation Plateforme Affymetrix: Pocédure Workflow : 4 jours Puces à SNP: Analyse des résultats Chaque Probe Cell émet une fluorescence dont l’intensité et la nature renseigne sur le génotype de l’individu pour chaque SNP. Puces à SNP: Analyse des résultats AA AB BB La détermination du génotype se fait sur la base de l’intensité de la fluorescence de chaque allèle. AA AB BB Deletion Normal Duplication Normal AA AB BB A B B B A A A A B B A B Normal Deletion B B A A A A B B B A A A Duplication A B B A B A B B A B AAA BBB AAB ABB Puces à SNP: Analyse des résultats Puces à SNP: Analyse des résultats Duplication Log ratio Allele peaks Puces à SNP: Visualisation des résultats CNV Gènes Bandes Délétion non-mosaïque Délétion mosaïque Puces à SNP: le mosaïcisme Puces à SNP: la consanguinité Les puces à SNP sont un bon moyen pour rechercher les régions homozygotes d’un individu ou d’une famille, permettant de faire des études de liaison ou cartographie génétique. Puces à SNP: la consanguinité Région d’Homozygotie (ROH) Perte d’Hétérozygotie (LOH) Chromosome 2 Small deletion LOH with normal copy number Puces à SNP: la consanguinité Puces à SNP: la consanguinité Exemple d’individu ayant un Longue région ROH Relationship Coefficient of Inbreeding Theoretical level of LCSH (based on total of 2850 Mb minus X and Y) Empiric Level of LCSH Theoretical Percent LCSH Siblings/Parent-Child 1/4 712.5 Mb 550-950 Mb 25.0% Half Siblings/Uncle- Niece/Aunt- Nephew/Double First Cousins 1/8 356.25 Mb 250-635 Mb 12.5% First Cousins/Half Uncle-Niece/Half Aunt-Nephew 1/16 178.5 Mb 100-300 Mb 6.25% First Cousins Once Removed/Double Second Cousins 1/32 89.0 Mb 30-75 Mb 3.12% Second Cousins 1/64 44.5 Mb >30 Mb 1.56% Analyse chromosomique par puce à ADN • L’ACPA détecte les déséquilibres génomiques appelés CNV. • Un CNV correspond à uploads/Finance/ cr-8-cytoge-ne-tique-mole-culaire.pdf