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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUP

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE DE LAGHOUAT AMAR THELIDJI FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Niveau : 2ème année License en biologie Module : Immunologie Exposé sous le titre Réalisé par : Dirigé par :  BEHAT Leila  NEBAG Halima  BEKHAOUA Hidaya  CHETTIH Anfal  CHOUIREB Imane  FARHAT Nadine  GUEDDOUDA Bouchra Groupe : G5 2020/2021 LES TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES (AG-AC) TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES (Ag-Ac) -2- SOMMAIRE Introduction …………………………………………………………. 3 1. Réaction Ac-Ag ……………………………………………………… 4 1.1 Les bases moléculaires de la réaction…………………………. 4 1.2 Aspects de la réaction…………………………………...……… 5 1.3 Caractéristiques de la réaction Ac/Ag………………………… 5 2. Réactions des précipitations en immunologie……………………… 6 2.1 Réaction de précipitation en milieu liquide…………………... 6 2.2 Réaction de précipitation en milieu gélifié……………………. 6 2.2.1 En tube ………………………………………………….. 6 2.2.2 Sur plaque ……………………………………………… 6 2.2.2.1 Immunodiffusion ……………………………… 7 2.2.2.2 Immunodiffusion double …...………………… 7 2.2.2.3 Immunoélectrophorèse ………………………. 7 3. La technique d’agglutination……………………………………….. 8 3.1 Technique directes ou active…………………………………... 8 3.2 Technique indirecte ou passive……………………………… 9 3.3 Techniques d’inhibition d’agglutination……………………... 9 4. Les technique Immuno Enzymatique …………..………………… 9 4.1 Technique fluorescence 9 4.2 Théqniques dosage radio – immunologique …………………. 10 4.3 Technique dosage IRMA ……………………………………… 10 Conclusion……………………………………………………………. 11 Bibliographie………………………………………………………… 12 TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES (Ag-Ac) -3- Introduction Les techniques immunologiques dépendent des interactions entre l’antigène et l’anticorps, car l’immunité en elle-même est la capacité du corps à résister à certaines substances nocives telles que les bactéries et les virus grâce à un système complexe constitué d’ un groupe de cellules, de molécules et de tissus appelé système immunitaire. Après plusieurs années de tests, les biologistes ont pu comprendre in vivo les interactions entre Ag et Ab. Cela leur a permis d’utiliser ces principes pour développer des techniques de recherche ou d’examen de différentes substances ou molécules de l’organisme en laboratoire. Si nous recherchions Ag, alors le réactif utilisé serait l’Ac correspondant et vice versa. Les réactions Ag-Ac in vitro sont soit des réactions directes dont le résultat est visible sans astuce (sédimentation, agglutination), soit des techniques avec marquage permettant de visualiser la liaison Ag-Ac. Cela peut se faire par un objet radioactif : marquage par radioimmunologie, par un objet fluorescent : immunofluorescence ou par une enzyme : immunohistochimie.. TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES (Ag-Ac) -4- 1/ Réaction Ac-Ag 1.1/ Les bases moléculaires de la réaction a- L'antigène Considérée comme étrangère de l'organisme, C'est une molécule qui contient des épitopes dont la structure est particulièrement définie ,et reconnus par les sites de liaisons des anticorps. L'antigène peut porter plusieurs épitopes ce qui détermine sa valence . b- L'anticorps Les anticorps sont caractérisés par la présence des paratopes qui varient selon l'anticorps reconnaissant ainsi un antigène. c- Le complexe immun Le complexe immun est une combinaison de l'Ac avec l'Ag L'interaction entre épitope et paratope est considérer comme la clé du complexe Ac-Ag. La complémentarité entre épitope et paratope induit la formation du complexe immunitaire: Si l'épitope correspond au paratope alors il y a présence d'une force d'attraction , si non on a une force de répulsion. La réaction entre Ac-Ag est une combinaison spécifique et réversible des Ac et Ag correspondant. Figure -1- Figure -3- Figure -2- TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES (Ag-Ac) -5- 1.2/ Aspects de la réaction a- Forces attractives intramoléculaires -Il s'agit d'un ensemble de forces qui fusionnent les Ac aux Ag correspondants. -Il existe 4 types de forces non covalentes; dépendantes de la complémentarité entre les sites d' Ac et les déterminant des Ag Forces non- covalentes Liaison Application Schématisation Liaisons hydrogène Deux atomes Electronégatifs partagent un atome d'hydrogéne Liaison hydrophobes L'interaction est difficile entre les groupes hydrophobes et l'eau qui se réuni pour exclure l'eau Forces de Van Der Waal Résultent de la fluctuatif on des nuages électroniques de charge opposé autour des molécules. Forces électrostatiques ou ioniques attraction entre atomes de charges opposées b- l'affinité C'est la somme des forces d'attractions et de répulsions entre un épitope et un paratope. Définie par la réaction : Ag+Ac Ag-Ac c- l'avidité c'est la force de fusion d'un anticorps possédant multiples paratopes avec un antigènes contenant plusieurs épitopes. Ainsi l'avidité est supérieur à la somme des affinités. Donc l'avidité est influencé par la valence, tout comme la T, le pH et la force ionique. 1.3/ Caractéristiques de la réaction Ac/Ag 1. Exothermique : la formation d’une liaison Ac/Ag libérant de l’énergie, ce qui influence la température et donc un bon déroulement de la réaction. 2. Réversible : les liaisons qui s’effectuent entre l'Ac et l’Ag sont des liaisons faibles, facilement rompues. 3. La complémentarité entre épitope et paratope induit la formation du complexe immunitaire: Si l’épitope correspond au paratope alors il y a présence d’une force d’attraction ,si non on a une force de répulsion. TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES (Ag-Ac) -6- 4. La réaction entre Ac-Ag est une combinaison spécifique et réversible. 2/ Réactions des précipitations en immunologie 2.1/ Réaction de précipitation en milieu liquide a. Le ring-test ou test de l'anneau : Les deux phases (phase inférieure contenant l’anticorps et phase supérieure contenant l’antigène) ne sont pas mélangées. L’antigène descend lentement au contact de l’anticorps pour former un complexe Ac-Ag à la zone d’équilibre de la courbe de précipitation. La position de l'anneau indique la présence de l'Ag ou de l'Ac que l'on recherche. Cet ancien test, surtout qualitatif, est un peu quantitatif par la position de l'anneau : plus il y a d'antigène, plus l'anneau est bas. b. Techniques de néphélémétrie : Un rayon laser traverse le tube contenant d’éventuelles particules du précipité. La diffraction de la lumière par les particules (nephelos = nuage) est mesurée à la sortie. Plus il y a de précipité Ac-Ag, plus il y aura de signal sur le photomultiplicateur (appareil qui mesure la diffraction). La mesure, rapide et automatisée, permet un dosage quantitatif. 2.2/ Réaction de précipitation en milieu gélifié Lorsqu’un antigène et un anticorps sont introduits dans un milieu gélifié en des points différents, ils diffusent et des précipités peuvent se former au point de rencontre si le rapport des concentrations d’antigène et d’anticorps s’y prête. On distingue, selon le type de support sur lequel le gel est appliqué, l’immunodiffusion en tubes ou en plaques. 2.2.1/ En tube C’est historiquement la première des techniques d’immunoprécipitation en gel puisqu’elle a été décrite par Oudin en 1946. Le principe de la technique consiste à remplir un tube de verre avec un gel d’agar dans lequel un anticorps a été préalablement incorporé, puis à appliquer une solution d’antigène dans le tube. L’antigène progresse rapidement par simple diffusion dans le gel en créant un gradient de concentration. Si la concentration initiale d’antigène est suffisante, un précipité se forme au niveau du front de progression de l’antigène. 2.2.2/ Sur plaque Dans ce test, une goutte de chacun de l'antigène et de l'antisérum est ajoutée sur une lame, puis l'antigène et l'antisérum sont mélangés par agitation. La réaction observée sous forme de Figure -4- TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES (Ag-Ac) -7- formation de flocules. Le test VDRL pour la syphilis est l'un des exemples de floculation sur lame. 2.2.2.1/ Immunodiffusion La caractéristique importante de cette méthode est que la réaction de précipitation est observable sous la forme d’une bande distincte qui est plus stable et si nécessaire peut être souillée pour la préservation. Le nombre d’antigènes différents dans le mélange réactif peut être facilement visualisé, car chaque réaction antigène-anticorps donne lieu à une ligne de précipitation. L’immunodiffusion indique également l’identité, la non identité et la réaction croisée entre différents antigènes. L’immunodiffusion est habituellement effectuée dans une gélose molle (1%) ou un gel d’agarose. 2.2.2.2/ Immunodiffusion double ou réaction d'Ouchterlony Les solutions d'Ag et d'Ac sont déposées dans des puits percés à distance les uns des autres dans un gel d'agarose. Les molécules diffusent dans le gel en fonction de leur taille et forment des lignes de précipitation pour chaque système d'Ag et d'Ac. Chaque ligne de précipitation correspond à la zone d'équivalence respective, c'est-à-dire à la formation d'un réseau Ag-Ac. Cette méthode permet l'analyse d'un mélange d'Ag et l'identification de ses constituants. Lorsque deux protéines diffusent dans un gel à la rencontre des Ac, on distingue des réactions d'identité, de non-identité ou d'identité partielle. 2.2.2.3/ Immunoélectrophorèse Une autre application simple et très discriminative de l’immunodiffusion est l’immunoélectrophorèse. Le principe de la technique consiste à introduire un mélange d’antigènes dans un puits creusé dans une plaque d’agar et à appliquer un champ électrique pendant une à deux heures afin de séparer les molécules d’antigène selon leur mobilité Figure -5- Figure -6- TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES (Ag-Ac) -8- électrophorétique. Le champ électrique est alors coupé et un antisérum polyspécifique est introduit dans une rigole parallèle au champ de migration de la préparation d’antigène. Les anticorps et les antigènes diffusent alors librement les uns vers les autres et donnent lieu à des précipités analogues à ceux décrits dans la méthode d’Ouchterlony. L’immunoélectrophorèse s’est révélée particulièrement spectaculaire pour l’analyse des protéines du sérum, permettant d’objectiver plus de 30 molécules différentes. De plus cette technique à longtemps été utilisée pour détecter la présence d’une immunoglobuline monoclonale dans le sérum de uploads/Finance/ immunologie.pdf