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Chapitre 4 : Maintenance et variations du matériel génétique Professeur Joël LU

Chapitre 4 : Maintenance et variations du matériel génétique Professeur Joël LUNARDI Année universitaire 2011/2012 Université Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits réservés. UE1 : Biochimie – Biologie moléculaire Chapitre 4. Maintenance et variations du matériel génétique I. Maintenance de l’ADN III. Recombinaisons 1- Altération 2- Mécanismes de correction 3- Correction immédiate 4- Correction secondaire 5- Correction translésionnelle IV. Transpositions 1- Modèle procaryote 2- Recombinaison homologue des eucaryotes 3- Recombinaison homologue et réparation 4- Recombinaison intra-brin 1- Transposition d’ADN 2- Rétrotransposition II. Variations 1-Types de variations 2- Conséquences des variations 3- Principaux polymorphismes I. Mécanismes de maintenance de l ’ADN I. Mécanismes de maintenance de l ’ADN réactifs génotoxiques accidents spontanés erreurs de réplication check-point du cycle cellulaire systèmes de réparation apoptose mutations maladies génétiques, cancers... ADN réparé détection des dommages « by-pass » polymérases DOMMAGES 1. Altérations physiques : chaleur, rayonnement cosmique, radioactivité, UV ... UV dimère cyclobutane Photosensibilisation / stress oxydant (bases oxydées, cassures) Absorption directe (dimères de pyrimidines) UVB UVA Visible 280 300 320 340 360 380 400 420 440 Longueur d’onde (nm) chimiques : - réactifs alkylants (EMS, diméthylnitrosamine…) - réactifs pontants interbrins (psoralène, cis-platine…) - molécules intercalantes - analogues de bases (5-bromouracile, 2-aminopurine….) Benzo[a]pyrène ADN BPDE-10-N2-dG physiologiques : - erreurs de réplication - phénomène de tautomérisation - oxydation (ions superoxyde, 8-oxo guanine…) - désamination: (cytosine uracile; adénine hypoxanthine) - acidification cellulaire et dépurination Exemple : l’inflammation est à l’origine d’espèces réactives de l’oxygène et d’espèces réactives du chlore et de l’azote elles aussi à l’origine de lésions de l’ADN N N NH2 dR O Cl N N NH2 dR O Cl HN N N N dR O H2N NO2 HN N N N dR O H2N NO2 N H N N N O N H 2 O H dR 8-oxo G 5-chloro C 8-nitro G U X X X X X (CH3)n A G X X X X A A T T incorporation d’uracile modification de base alkylation adduits volumineux pontage intra-brin 5’ 5’ coupure double-brins pontage inter-brin site abasique coupure simple-brin dimère de thymine mésappariement Principaux types de lésions de l’ADN 2. Correction des dommages 2. Correction des dommages 2.1. prévention - superoxyde dismutase, catalase, peroxydases O2° , H2O2, OH° - antioxydants (NADPH, glutathion, vit E) oxydation - tampons physiologiques acidification - 2.2. mécanismes de correction correction des mésappariements excision de nucléotides (NER) correction immédiate lésions UV adduits chimiques excision de base (BER) excision courte excision longue lésions oxydatives adduits monofonctionnels réparation des cassures réparation secondaire +/- TCR (Transcription Coupled Repair) U X X X X X (CH3)n A G X X X X A A T T incorporation d’uracile modification de base alkylation adduits volumineux pontage intra-brin 5’ 5’ coupure double-brins pontage inter-brin site abasique coupure simple-brin dimère de thymine mésappariement Principaux types de lésions de l’ADN BER NER HR/NHEJ MMR Correction immédiate 3. correction immédiate erreurs d’incorporations ≈1/104 pb vs 1/108 pb final arrêt de la polymérase activité 3’-5’ exonucléase reprise de synthèse 5’- 3’ photolyases réversion directe par des alkyltransférases (ex: O6-méthylguanine- DNA méthyl transférase = MGMT) activité 3’-5’ exonucléase des polymérases 2.4. correction secondaire 4. correction secondaire 4.1. réparation par excision de bases (BER) 1. reconnaissance - excision de la base par une glycosylase spécifique: formation d’un site AP (apurique/apyrimidique) - coupure du brin d ’ADN après reconnaissance du site AP par AP endonucléases 5’ 3’ 5’ 3’ OH 5’ 5’ 5’ 3’ 3. DNA ligase 5’ 2.a - réparation « short patch » : ADN pol , XRCC1 2.b - réparation «long patch » : exonucléases, ADN pol, PCNA, RF-C, FEN1 endonucléase 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 4.2. réparation par excision de nucléotides (NER) Global Genome Repair (GGR) tiré de Friedberg EC, Nature Reviews Cancer, 2001 2. synthèse réparatrice et ligation (PCNA, DNA pol et , ligase) 1. phase de reconnaissance, d’ouverture du double brin et d’excision par le complexe excinucléase : - activité endonucléase ATP dépendante - ≈ 16 protéines chez l’homme (XPA--- XPG, ERCC1---ERCC6, TFIIH…) 1. phase de reconnaissance de la lésion située sur le simple brin en cours de transcription par la machinerie de transcription 2. formation du complexe de réparation couplé à la transcription avec pause de la transcription 3. réparation avec mise en œuvre des facteurs protéiques responsables du NER puis synthèse réparatrice et ligation. reprise de la transcription Transcription Coupled Repair (TCR, réparation couplée à la transcription) ARN Machinerie de transcription adapté de Friedberg EC, Nature Reviews Cancer, 2001 Réparation des cassures double brin 4.3. réparation des cassures double brin Réparation des cassures double brin recombinaison homologue raboutage double-brin Ku70, Ku80 DNA-PKcs Nbs1, Mre11, Rad50, XRCC4 ligase NHEJ: non homologous end joining Réparation des cassures double brin recombinaison homologue raboutage double-brin Ku70, Ku80 DNA-PKcs Nbs1, Mre11, Rad50, XRCC4 ligase Correction des mésappariements 4.4. correction des mésappariements 3’ 3’ G T MSH6/MSH3 1. reconnaissance du mésappariement par MSH2 et MSH6 ou MSH3 3’ 3’ G T MSH2 ATP ADP 3’ 3’ G T MLH1 PMS2 ATP ADP 2. recrutement de MLH1 et PMS2 et ouverture du brin lésé 3’ 3’ G T Exo 1 3. déplacement du complexe et recrutement de l’exonucléase 1 au niveau du site de coupure 3’ 3’ G RPA 4. digestion 3’-5’ par exo 1 et protection du simple brin par le facteur RPA 3’ 3’ G C 4. re-synthèse du brin complémentaire par ADN pol en présence des facteurs PCNA et RF-C puis finition par ADN ligase Le mécanisme de correction des mésappariements avait été initialement décrit chez la bactérie ( MutS = dimère MSH2-MSH6 Mut L = MLH1-PMS2) puis découvert chez les eucaryotes et l’homme « bypass » polymérases 5. Polymérases translésionnelles ou « by pass » polymérases Les déficits des systèmes de réparation les déficits des systèmes de réparation sont à l ’origine de prédispositions aux cancers - mutation des gènes XP et sensibilité aux UV : xeroderma pigmentosum - déficit du NER : syndrome de Cockaine, trichiodystrophie - déficit des systèmes de réparation des cassures: syndrome de Bloom, syndrome de cassure de Nijmegen - déficit des systèmes de réparation des mésappariements (gènes MLH1, MSH2, MSH6 …) : HNPCC - déficit des systèmes de reconnaissance: - gène ATM & ataxie télangiectasique - mutation du gène p53 & tumeurs multiples - déficit du contrôle du cycle cellulaire : gènes BRCA1, BRCA2 & cancers du sein + La réparation de l’ADN : facteur de résistance vis-à-vis de certains anticancéreux tiré de Neidle et coll, Nature Reviews Cancer, 2005 Une réparation trop importante peut diminuer l’efficacité du traitement + Variations de l ’ADN 2. Conséquence d’une variation : mutation vs polymorphisme gène A gène B la modification change le message exprimé : allèle muté = mutation) la modification ne change pas le message exprimé : allèle polymorphe = polymorphisme II. Variations de l ’ADN 1. Type de variants moléculaires modifications « ponctuelles » - substitutions : A ou G > T ou C = transversion A > G, C > T = transition - délétions (del) : 1 à plusieurs milliers de pb - insertions (ins) : 1 à plusieurs milliers de pb réarrangements chromosomiques : trisomies, translocations… population générale : ≈ 1 variation / 2000 pb soit ≈ 2 000 000 au total par génome haploïde ! Conséquence d’une variation 3. Polymorphismes fréquents 3.1. Les SNPs (pour Single Nucleotide Polymorphism) : variation d’1 nucléotide (≈ 1 tous les 2-3000 pb ! ) 5’--ATCGCTATC--- --ATCGATATC--- --TAGCGATAG--5’ --TAGCTATAG-- séquence de référence séquence polymorphe C > A La modification peut éventuellement altérer le site de reconnaissance d’un enzyme de restriction : polymorphisme de restriction (voir chapitre 8) Si la présence d’un polymorphisme donné chez un individu se révèle sans conséquence sur l’expression du message génétique, la présence simultanée de plusieurs polymorphismes particuliers peut dans certains cas s’accompagner d’une modification de l’expression génétique: on parlera alors de polymorphismes modificateurs… ou Les polymorphismes de répétitions de type microsatellites 3.2. Les polymorphismes de répétitions de type microsatellites chr 1a chr 1b allèle 1a = 99 CA allèle 1b = 102 CA 5 ’ 3 ’ 5 ’ 3 ’ 5’ ---ATCGTCACACACA--CACACACACTGGTCA--- ---TAGCAGTGTGTGT--GTGTGTGTGACCAGT---5’ 5’ ---ATCGTCACACACA--CACACACACACACACTGGTCA--- ---TAGCAGTGTGTGT--GTGTGTGTGTGTGTGACCAGT---5’ - groupe des VNTR courts (Variable Number Tandem Repeats) - motifs de 2, 3 ou 4 nucléotides - nombreux ( > 50 000 dans le génome humain) - le nombre de répétition varie suivant le microsatellite étudié - le nombre d’allèles est généralement compris entre 2 et 10 - le nombre de répétitions ne varie généralement pas lors de la transmission - les séquences de part et d’autre du microsatellite sont en principe identiques pour les différents allèles d’un microsatellite et permettent l’analyse du nombre de répétitions par amplification PCR et séquençage (voit chapitre 8) Les polymorphismes de répétitions de type minisatellites (VNTR*) 3.3. Les polymorphismes de répétitions de type minisatellites chr 7a chr 7b allèle 7a = 3 répétitions allèle 7b = 5 répétitions 5 ’ 3 ’ 5 ’ 3 ’ 5’ 5’ 5’ 5’ - groupe des VNTR longs (Variable Number Tandem Repeats) - séquences de 9 à 80 de paires de bases - un uploads/Finance/ lunardi-joel-p04.pdf