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L’urée 1. Technique de dosage Le dosage de l’urée est demandé pour objectiver u

L’urée 1. Technique de dosage Le dosage de l’urée est demandé pour objectiver une insuffisance rénale. Bien que cette mesure soit peu fiable, l’urée ne dépassant les limites de la normale que pour une réduction néphrotique de plus de moitié. A. Le principe L’urée plasmatique est déterminée quantitativement par un test enzymatique. Le principe du dosage repose sur la réaction suivante : Sous l’action de l’uréase l’urée est hydrolysée en dioxyde de carbone (CO2) et ammoniac NH2-CO-NH2 + (H2O) 2 NH4+ + CO2 L’ammoniac formé réagit ensuit avec l’α-cétoglutarate et le Nicotinamide AdenineDinucleotide- Hydrogène (NADH) en présence de Glutamate déshydrogénase (GLDH) avec formation de glutamate et de Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide (NAD) : COOH-CO-(CH2)2-COOH+NH4+NADH COOH-CH(NH2)-(CH2)2-COOH+NAD+H2O B. Mode opératoire La mesure de l'urémie est obtenue par l'analyse d'un prélèvement sanguin réalisé par ponction veineuse. Il arrive parfois que le dosage sanguin soit accompagné d'un dosage de l'urée dans les urines pratiqué sur une durée de 24 heures. La réaction est déclenchée par l’addition du réactif R1 (Tampon PH 9,65) et du réactif R2 (sodium hypocholorite) selon les quantités indiquées dans le tableau suivant : Tableau 4 : Mode opératoire du dosage de l’urée Blanc Etalon Contrôle Echantillon Tampon (µL) 250 250 250 250 Sodium hypochlorite (µL) 150 150 150 150 Eau distillé (µL) 4 - - - Etalon - 4 - - Contrôle - - 4 - Echantillon - - - 4 Uréase GLDH C. Lecture et résultats Les valeurs normales de l'urémie sanguine sont comprises entre 0,18 et 0,45 g/l chez l'homme, et entre 0,15 et 0,42 g/l chez la femme. La cinétique de l’absorption est mesurée à 340 nm. La diminution de l’intensité, due à la concentration de NADH est ensuite mesurée par une méthode cinétique, elle est proportionnelle à la concentration de l’urée dans l’échantillon. 2.3.2. Méthode du dosage de la créatinine Comme la créatinine est éliminée uniquement par filtration glomérulaire et elle ni réabsorbé, ni sécrétée (ou très peu) par le tubule, il existe une corrélation entre la concentration plasmatique de la créatinine et le débit de filtration glomérulaire. A. Principe C’est un test colorimétrique cinétique, qui permet la détermination quantitative de la créatinine plasmatique. Le principe repose sur la réaction suivante : Milieu alcalin Créatinine + acide picrique + NaOH complexe créatinine-acide picrique B. Mode opératoire Cette réaction est déclenchée par l’addition des deux réactifs : R1 (NaOH) R2 (Acide picrique) à l’échantillon selon les quantités portées dans le tableau suivant : Tableau 5 : Mode du dosage de la créatinine. Blanc Etalon Contrôle Echantillon NaOH (µL) 250 250 250 250 Acide picrique (µL) 50 50 50 50 Eau distillé (µL) 15 - - - Etalon (µL) - 15 - - Contrôle (µL) - - 15 - Echantillon (µL) - - - 15 C. Lecture et résultats En milieu alcalin la créatinine forme avec le picrate un complexe jaune orangé. L’intensité de la coloration développée est directement proportionnelle à la concentration de la créatinine. Cette intensité est mesurée par photométrie à une longueur d’onde de 512 nm. 2.3.5. Méthode de dosage de la CRP La CRP est un marqueur précoce, sensible et spécifique des réactions inflammatoires. Elle est secrétée par les cellules du foie en réponse à un antigène ; son taux augmente et devient maximale après une inflammation aigue (DAYER et al., 2006) ;(MAURIS et al., 2005) Dans notre étude le dosage de la CRP s’est effectué selon deux méthodes de dosage 2.3.5.1. Méthode du dosage de CRP-latex A. Principe Le CRP-latex est un test d’immunoagglutination qui permet la détection qualitative et de la CRP au niveau du sérum humain. Les anticorps se lient spécifiquement avec la CRP sérique, ce qui donne une agglutination. B. Mode opératoire Le dosage de CRP latex se fait sur des lames (plaques). Avec une baguette on mélange une goutte du R 2 (Immunoglobuline anti CRP humaine) avec 5 µL de l’échantillon. C. Lecture et interprétation des résultats Les particules de latex anti CRP humaine sont agglutinées avec la CRP contenant dans le sérum, et l’agglutination étant visible sur la lame, en comparant avec le contrôle positif et négatif. 2.3.5.2Méthode du dosage de CRP-turbilatex Le CRP-turbilatex est un test d’immunoturbidimétrie permettant la détermination quantitative de la CRP sérique. Dont l’absorbance dépend de la quantité de CRP présent dans l’échantillon. B. Mode opératoire On prépare la solution de travail avec 1 volume R1 (Tampon PH 7,4) pour 4 volumes R2 (Anti-CRP humaine). Le mélange réactionnel est constitué comme suit : 32 Matériel et méthodes Tableau 7: Mode opératoire du dosage de la CRP. Etalon Contrôle Echantillon Solution de travail (mL) 1 1 1 Etalon (µL) 5 - - Contrôle (µL) - 5 - Echantillon (µL) - - 5 Après avoir agité les mélanges, l’absorbance est mesurée dans un intervalle de temps de 5min (A1) et (A2). C. Lecture et interprétation des résultats L’agglutination qui en résulte est mesurée par turbidimétrie à une longueur d’onde 540 nm. 2.3.6. Méthode de dosage de la transferrine La transferrine (sidérophiline) est une glycoprotéine synthétisée dans le foie. C’est la protéine plasmatique principale de transport du fer. l’évaluation des niveaux de transferrine sérum/plasma est utile pour le diagnostic différentiel de l’anémie et pour contrôler son traitement (BERGSTROM et al., 1980). A. Principe Le dosage de transferrine se fait par un test d’immunoturbidimétrique qui permet la détection qualitative de la transferrine.au niveau du sérum humain. La transferrine humaine et la turbidité induite par la formation du complexe immun antigène-anticorps. 3. Outil statistique Pour calculer les moyennes et les variances de nos échantillons nous avons utilisé l’office Excel 2010. Nous avons complété notre travail par une étude statistique qui comporte la construction des intervalles de confiance. uploads/Finance/ methodes-de-dosage-des-differents-parametres.pdf