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DOSAGE DES PHOSPHATASES Rappel La conservation des échantillons de sol devant s

DOSAGE DES PHOSPHATASES Rappel La conservation des échantillons de sol devant servir aux analyses enzymatiques doit toujours se faire à (+4°C) Pesées La prise d’essai est de 100mg de sol pour la phosphatase ; cependant cela n’est pas une règle absolue, ce poids peut varier selon la nature du sol. On fait quatre (4) pesées par échantillon de sol : le premier sera le témoin enzyme(TE) et les trois autres constituent les essais (E). Tampons et pH On utilise d’une part le tampon Mc Ilvain ou le tampon Universel Modifié à pH compris entre 5.8 et 6 pour la phosphatase acide et d’autre part le tampon Universel Modifié à pH 11 pour la phosphatase alkaline. 1) Tampon Mc Ilvain ou (Citrate Phosphate Buffer): Solution A à 0,1M : Dissoudre 19,21g d’acide citrique dans 1000ml d’eau déminéralisée. Solution B à 0,2M : Dissoudre 53,65g de Na2HPO4 ,5H2O (Dibasic Sodium Phosphate) ou dissoudre 71,7g de Na2HPO4, 12H2O dans 1000ml d’eau déminéralisée. Pour préparer le tampon proprement dit au pH voulu, on fait le mélange des deux solutions A et B selon le tableau ci-après Exemple : x ml d’A + y ml de B dilué à un volume total de 100 ml. Voir tableau de correspondance ci-dessous. A(X) B(Y) pH 44,6 5,4 2,6 42,2 7,8 2,8 39,8 10,2 3 37,7 12,3 3,2 35,9 14,1 3,4 33,9 16,1 3,6 32,3 17,7 3,8 30,7 19,3 4 29,4 20,6 4,2 27,8 22,2 4,4 26,7 23,3 4,6 25,2 24,8 4,8 24,3 25,7 5 23,3 26,7 5,2 22,2 27,8 5,4 21 29 5,6 19,7 30,3 5,8 17,9 32,1 6 16,9 33,1 6,2 15,4 34,6 6,4 13,6 36,4 6,6 9,1 40,9 6,8 6,5 43,6 7 2) Tampon Universel Modifié Solution stock : Dissoudre dans 500ml de NaOH 1M successivement le produit suivant : -12,1g de Tris (hydroxyméthy) aminométhane -11,6g d’acide maléique -14g d’acide citrique monohydrate -6,3g d’acide borique -compléter à 1000ml avec de l’eau déminéralisée et garder à (+4°C) Tampon à pH6 : prélever 200ml de la solution stock + 500ml D’eau déminéralisée, ajusté le pH à 6 avec de HCl et compléter à 1L. Tampon à pH 11 : prélever 200ml de la solution stock+ 500ml D’eau déminéralisée, ajusté le pH à 11 avec de NaOH et compléter à 1L. Remarque : les solutions stock comme le tampon se conservent à (+4°C). 3) Le substrat Solution de PNPP 100mg dans 10ml à 5mM d’eau déminéralisée à garder à –20°C et en flacon fumé ou par défaut protéger avec du papier aluminium. PNPP signifie (p- Nitrophenyl Phosphate). Le substrat ne doit pas être gardé pendant plus de deux jours s’il n’est pas congelé. 4) Les réactifs Solution de CaCl2 à 0,5M : Dissoudre 73,5g de CaCl2, 2H2O dans 1L d’eau déminéralisée. Solution de NaOH à 0,5M : Dissoudre 20g de soude dans 1L d’eau déminéralisée. Ces deux solutions se conservent à la température ambiante. 5) Le Dosage et incubation Témoin Substrat(TS) : 400µl de tampon + 100µl de pNPP Témoin Enzyme(TE) : 400µL de Tampon + 100mg de sol + 100µl H2O Essai (E) : 400µl Tampon + 100mg de sol +100µl pNPP Vortexer doucement et incuber pendant 1h dans une étuve réglée à 37°C et sous agitation .Un seul tube pour Témoins substrats suffit pour toute la manip. 6) Arrêt de la réaction Au bout d’une heure de temps, on sort les tubes de l’étuve et on ajoute 100µl de la solution de CaCl2 dans tous les pour complexer la réaction. Agiter et ajouter 400µl de NaOH pour enfin arrêter la réaction. Le contenu est versé dans les tubes eppendorfs et centrifugé pendant 5mn à 10 000 tours. On récupère le surnageant et on le passe au spectrophotomètre. 7) Lecture La lecture de la densité optique se fait à la longueur d’onde de 400nm et prenant comme référence un témoin blanc H2O. Lire ensuite le témoin substrat. Changer de cuve et lire successivement témoin enzyme et les essais. 10µg de pNPP correspond à une DO de 0,420. PROTOCOLE DE LA FLUORESCEINE DIACETATE Rappel. La conservation des échantillons de sol devant servir aux analyses enzymatiques doit toujours se faire à (+4°C) Pesées Prise d’essai optimisé à 1g de sol pour la fluorescéine diacétate : cependant cela n’est pas une règle absolue, ce poids peut varier selon la nature du sol. On fait 4 pesées par échantillon de sol : le 1er sert de témoin enzyme (TE) et les trois autres constituent les essais (E). Prévoir un tube sans sol pour témoin substrat (TS). A cause de l’acétone, il est préférable d’utiliser des tubes en verre. 1) Tampons et pH : On utilise le tampon potassium phosphate au pH 7,6 Tampon potassium phosphate : Solution stock de k2HPO4 et de KH2PO4 à 60 mM : Dissoudre 8,7g de K2HPO4 et 1,3g de KH2PO4 dans 800ml d’eau déminéralisée. Ajuster le pH à 7,6 avec de NaOH. Compléter à 1L et garder 4°C. 2) Substrat : C’est la fluorescéine diacetate ou FDA : réf : F7378 (sigma) Préparer une solution à 1mg /ml dans de l’acétone et conserver à –20°C. 3) Réactifs : On utilise soit le mélange chloroforme/méthanol (2 : 1) ou de l’acétone à 100%. Pour la première option : prélever 666ml de chloroforme et compléter à 1L avec du méthanol. 4) Dosage : TS (témoin substrat) : 15ml de tampon + 200µl de FDA TE (témoin enzyme) : 15ml de tampon+ 200µl H2O + 1g de sol E (essai) : 15ml de tampon + 200µl de FDA + 1g de sol Boucher les tubes et vortexer légèrement. Incuber pendant 1h sous agitation à 30°C. 5) Arrêt de la réaction : Il se fait par le mélange chloroforme/méthanol ou par l’acétone à 100%. Au bout d’une heure d’incubation, prélever dans des tubes eppendorfs 1ml de cette solution et ajouter 1ml d’acétone. Vortexer et centrifuger pendant 5mn à 1000 tours/mn. 6) Lecture au spectrophotomètre : Prélever 1ml du surnageant et lire la DO au spectro à 490 nm. Remarque : Pour la lecture, faire l’auto zéro du spectro avec 0µg /ml de la fluorescéine standard. Lire dans l’ordre : Témoin substrat…. Essais. Faire un témoin substrat pour chaque échantillon. Utiliser des cuves spectro en verre à cause de l’acétone Gamme étalon de la fluorescéine. 1) Solution mère de fluorescéine à 1mg /ml Dissoudre 100mg de fluorescéine (F 7505 SIGMA) dans 100ml d’acétone. 2) Solution fille de fluorescéine à 100 µg/ml Diluer 1ml de la solution – mère dans 9ml d’acétone Calibration des standards : Faire 6 points de gamme de la manière suivante : 0µg : 1000µl de tampon + 1000µl d’acétone + 0µl de la solution standard 1µg : 990µl de tampon + 990µl d’acétone +10µl de la solution standard 2µg : 980µl de tampon + 980µl d’acétone +20µl de la solution standard 3µg : 970µl de tampon + 970µl d’acétone + 30µl de la solution standard 4µg : 960µl de tampon + 960µl d’acétone + 40µl de la solution standard 5µg : 950µl de tampon + 950µl d’acétone + 50µl de la solution standard Vortexer et lire la DO à 490 nm uploads/Finance/ protocole-des-activites-enzymatiques.pdf