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fraction Masse totale de protéine (mg) Mass X utilisée pour l’essai (mg) Volume

fraction Masse totale de protéine (mg) Mass X utilisée pour l’essai (mg) Volume V mesuré lors de l’essai cm 3 AC UI AS UI AT Rendement % enrichissement I. Tissus frais homogénéisation ou précipité par (NH4) 2SO4 re-dissolution du culot 120 0,1 5,20 52 520 62400 = 52 X 120 100 1 II. Fraction I1 soumise à une chromatographie sur DEAE- cellulose 14 0,01 2,30 23 2300 3220 51,60 4,42 III. Concentration et dialyse 13 0,01 2,40 24 2400 31200. 50 4,61 IV. Gel filtration sur Sephadex G200 6,5 0,01 4,20 42 4200 27300 43,75 8,07 V. Fraction passé sur DEAE-cellulose 1,3 0,01 7,90 79 7900 10270 16,45 15,19 I. Tissus frais homogénéisation ou précipité par (NH4) 2SO4 re-dissolution du culot 140 0,1 4,7 4,70 470 65800 100 1 fraction I soumise à une chromatographie d’affinité 4,7 0,01 9,75 97,5 9750 45825 69,64 20,74 TD Purification des enzymes et mesure de l’activité enzymatique L’acétylcholine esterase est une enzyme, catalyse l’hydrolyse de la réaction suivante La détermination de son activité catalytique peut se faire de la façon suivante Un volume de solution d’enzyme contenant X mg de protéine est ajouté à une solution d’acétylcholine en excès, on amène le PH à 7 et la température à 30°C Le pH a tendance de diminue a cause de l’acide libre, on détermine donc le volume V en cm3 de la solution de NaOH exactement 0,01 mole /dm3 nécessaire, par minute, pour maintenir le pH à sa valeur initial On compare deux techniques de purification de cette enzyme à partir d’un broyat d’un tissu animale 1ére technique : utilisation des procédés classique 2éme technique Utilisation de la chromatographie d’affinité 1/ complétez numériquement le tableau de purification en faisons pour chaque fraction  L’activité catalytique spécifique en UI/mg ;  L’activité totale de la fraction ;  Le rendement ;  L’enrichissement ; 2/ comparez les résultats obtenus dans les deux techniques La 2émé techniques est une chromatographe sur colonne, la colonne est constitue de particule d’agarose où sont fixée de façon covalent des molécules d’un inhibiteur compétitif de l’acétylcholine estérase. Exercice 02 : 1. 10µl d’extrait ureasique produit on une minute 3 µmole d’ammoniaque à pH 7 et à température de 30°C  Quelle est l’activité en mol /second de 1ml d’extrait ureasique ? 2. En purifie l’extrait par chromatographie pour éliminé certain protéines enzymatique les protéines récupéré se trouve à 24 mg/ml de solution, 10µl de cette solution transforme 26µl de substrat en 4 secondes  Quelles l’activité spécifique de cette nouvelle solution (mole. s-1.mg-1) ? 3. En poursuit la purification par deux nouvelle chromatographie échangeuse d’ions on obtient une préparation dont 10µl de cette solution transforme 30µl de substrat en 2 secondes  Quelles l’activité spécifique de cette nouvelle solution (mole. s-1.mg-1) ? Une dernière chromatographie donne une solution de 41 mg/ml de protéines,10µl de cette solution transforme 22µmole de substrat en 1 seconde  Quelles l’activité spécifique de cette nouvelle solution (mole. s-1.mg-1) ? uploads/Finance/ td-purification-des-enzyme.pdf