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HAL Id: tel-00595051 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00595051 Submitted on 23 May 2011 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Molécules antibactériennes issues d’huiles essentielles: séparation, identification et mode d’action E. Guinoiseau To cite this version: E. Guinoiseau. Molécules antibactériennes issues d’huiles essentielles: séparation, identification et mode d’action. Sciences du Vivant [q-bio]. Université de Corse, 2010. Français. tel-00595051 UNIVERSITE DE CORSE-PASQUALE PAOLI ECOLE DOCTORALE ENVIRONNEMENT ET SOCIETE UMR CNRS 6134 SPE Faculté des Sciences et Techniques Thèse présentée pour l’obtention du grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE CORSE Mention : Biochimie - Biologie moléculaire Soutenue publiquement par Elodie Guinoiseau le 06 décembre 2010 __________________________________________________________ Molécules antibactériennes issues d’huiles essentielles : séparation, identification et mode d’action __________________________________________________________ Jury Rapporteurs : Mme Foglino Maryline, Dr-HDR, Université de la Méditerranée M. Alziari Serge, Professeur, Université de Clermont Examinateurs : M. Bolla Jean-Michel, Dr-HDR, Inserm, Marseille M. Casanova Joseph, Professeur, Université de Corse Mme Berti Liliane, Professeur, Université de Corse Directrices : Mme Berti Liliane, Professeur, Université de Corse Mme Luciani Anne, Dr, Université de Corse SOMMAIRE AVANT-PROPOS ................................................................................................................ 1 INTRODUCTION 1- LES ANTIBIOTIQUES ...................................................................................................... 5 1-1 LES ANTIBIOTIQUES NATURELS ET SYNTHETIQUES ..................................................................................................... 5 1-2 LES CIBLES BACTERIENNES DES ANTIBIOTIQUES ......................................................................................................... 7 2- LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES ............................................................................. 9 2-1 LA RESISTANCE NATURELLE ................................................................................................................................. 9 2-2 LA RESISTANCE ACQUISE ...................................................................................................................................... 9 2-3 EPIDEMIOLOGIE DE LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES ........................................................................................... 11 2-4 LES MECANISMES DE RESISTANCE ........................................................................................................................ 11 2-4-1 Diminution de la concentration intracellulaire en antibiotiques ........................................................ 12 2-4-1-1 Modification de la perméabilité membranaire ............................................................................................ 13 2-4-1-2 Les systèmes d’efflux bactériens .................................................................................................................. 14 2-4-2 Dégradation et modification enzymatique des antibiotiques ............................................................ 16 2-4-3 Altération des cibles cellulaires des antibiotiques .............................................................................. 18 3- STRATEGIES MOLECULAIRES DE LUTTE CONTRE LA RESISTANCE BACTERIENNE ............ 19 3-1 LES NOUVELLES CIBLES BACTERIENNES .................................................................................................................. 20 3-1-1 Les β-lactamases ................................................................................................................................ 20 3-1-2 Les pompes d’efflux ............................................................................................................................ 22 3-1-3 Les facteurs de virulence .................................................................................................................... 26 3-1-3-1 Les toxines.................................................................................................................................................... 26 3-1-3-2 Les adhésines et les biofilms ........................................................................................................................ 28 3-1-3-3 Le quorum sensing ....................................................................................................................................... 29 3-1-3-3-1 Le quorum sensing chez les bactéries Gram négatives ....................................................................... 29 3-1-3-3-2 Le quorum sensing chez les bactéries Gram positives ......................................................................... 31 3-1-3-4 Les inhibiteurs des facteurs de virulence ..................................................................................................... 32 3-1-3-4-1 Les inhibiteurs des toxines .................................................................................................................. 33 3-1-3-4-2 Les inhibiteurs des adhésines .............................................................................................................. 33 3-1-3-4-3 Les inhibiteurs du quorum sensing ...................................................................................................... 34 3-2 LES NOUVEAUX ANTIBIOTIQUES .......................................................................................................................... 36 3-2-1 Les bactériophages ............................................................................................................................. 36 3-2-1-1 Les propriétés fonctionnelles des bactériophages ....................................................................................... 36 3-2-1-2 L’avenir de la phagothérapie ....................................................................................................................... 37 3-2-2 Les peptides antimicrobiens ............................................................................................................... 38 3-2-2-1 Les peptides cationiques antimicrobiens (PCAs) .......................................................................................... 38 3-2-2-1-1 Aspects structuraux ............................................................................................................................. 38 3-2-2-1-2 Mode d’action des PCAs ...................................................................................................................... 40 3-2-2-2 Les peptides anioniques antimicrobiens ...................................................................................................... 43 3-2-2-3 Les peptides antimicrobiens en développement clinique ............................................................................ 43 3-2-3 Les plantes .......................................................................................................................................... 44 3-2-3-1 Les plantes, source naturelle d’antimicrobiens ........................................................................................... 45 3-2-3-2 Les plantes, source naturelle d’inhibiteurs de l’efflux bactérien ................................................................. 46 3-2-3-3 Les plantes, productrices d’analogues des N-acylhomosérine-lactones (AHLs) ........................................... 48 3-2-4 Les huiles essentielles ......................................................................................................................... 48 3-2-4-1 Définition ..................................................................................................................................................... 49 3-2-4-2 Les activités biologiques des huiles essentielles .......................................................................................... 49 3-2-4-3 Les activités antibactériennes des huiles essentielles.................................................................................. 50 3-2-4-4 La composition des huiles essentielles......................................................................................................... 51 3-2-4-4-1 La composition chimique des huiles essentielles ................................................................................ 51 3-2-4-4-2 Les constituants des huiles essentielles .............................................................................................. 53 3-2-4-5 Mode d’action des huiles essentielles et de leurs principaux constituants ................................................. 56 MATERIEL ET METHODES 1- MATERIEL ................................................................................................................... 63 1-1 LES SOUCHES BACTERIENNES .............................................................................................................................. 63 1-2 LES HUILES ESSENTIELLES ................................................................................................................................... 63 1-3 LES ANTIBIOTIQUES .......................................................................................................................................... 63 2- METHODES ................................................................................................................. 64 2-1 METHODES MICROBIOLOGIQUES ........................................................................................................................ 64 2-1-1 Activité antibactérienne ..................................................................................................................... 64 2-1-1-1 Evaluation de l’activité antibactérienne par la méthode de diffusion par disque ....................................... 64 2-1-1-2 Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) .................................................................. 65 2-1-1-2-1 Technique de macrodilution en milieu liquide .................................................................................... 66 2-1-1-2-2 Technique de microdilution en milieu liquide ..................................................................................... 67 2-1-1-2-3 Technique de macrodilution en milieu solide...................................................................................... 67 2-1-1-3 Détermination de la Concentration Minimale Bactéricide (CMB) en milieu solide ..................................... 68 2-1-2 Dynamique d’action des huiles essentielles par mesure de la décroissance bactérienne (Time-kill assay) ........................................................................................................................................................... 69 2-1-3 Expérience de lyse cellulaire ............................................................................................................... 70 2-1-4 Microscopie Electronique à Transmission (MET) ................................................................................ 71 2-2 METHODES CHIMIQUES .................................................................................................................................... 72 2-2-1 Chromatographie sur colonne de silice (CC) ....................................................................................... 72 2-2-2 Chromatographie en phase gazeuse (CPG) ........................................................................................ 72 2-2-3 Résonance magnétique nucléaire (13C RMN) ..................................................................................... 72 2-2-4 Identification des composés ............................................................................................................... 73 RESULTATS ET DISCUSSION CHAPITRE 1 : ETUDE DU MODE DACTION DHUILES ESSENTIELLES A ACTIVITE ANTIBACTERIENNE .......................................................................................................... 71 1- RESULTATS.................................................................................................................. 76 1-1 CRIBLAGE DE L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DES HUILES ESSENTIELLES SUR STAPHYLOCOCCUS AUREUS ............................... 76 1-2 CARACTERISATION DU MODE D’ACTION DES HUILES ESSENTIELLES D’INULA GRAVEOLENS ET DE SANTOLINA CORSICA SUR STAPHYLOCOCCUS AUREUS ...................................................................................................................................... 78 1-2-1 Détermination des Concentrations Minimales Inhibitrice (CMI) et Bactéricide (CMB) des huiles essentielles d’Inula graveolens et de Santolina corsica ............................................................................... 78 1-2-2 Dynamique d’action des huiles essentielles d’Inula graveolens et de Santolina corsica : expérience de mort cellulaire .............................................................................................................................................. 79 1-2-3 Détermination de l’action lytique des huiles essentielles d’Inula graveolens et de Santolina corsica 81 1-2-4 Observation des effets cellulaires générés par les huiles essentielles d’Inula graveolens et de Santolina corsica en Microscopie Electronique à Transmission (MET) ........................................................ 83 2- DISCUSSION ................................................................................................................ 86 2-1 ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DES HUILES ESSENTIELLES D’INULA GRAVEOLENS ET DE SANTOLINA CORSICA ........................... 86 2-2 CARACTERISATION DU MODE D’ACTION DES HUILES ESSENTIELLES D’INULA GRAVEOLENS ET DE SANTOLINA CORSICA ............ 87 CHAPITRE 2 : MOLECULES IMPLIQUEES DANS LACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE LHUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS ............................................................................. 86 1- RESULTATS.................................................................................................................. 92 1-1 ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS .............................................................. 92 1-1-1 Analyses microbiologiques de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus .............................................. 92 1-1-1-1 Criblage de l’activité antibactérienne de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus par la méthode de diffusion par disque .................................................................................................................................................. 92 1-1-1-2 Tests de détermination de la CMI de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus ............................................ 94 1-1-2 Analyses chimiques de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus ......................................................... 96 1-2 MOLECULES IMPLIQUEES DANS L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS .................. 98 1-2-1 Chromatographie sur colonne de silice de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus ........................... 98 1-2-1-1 Analyses chimiques des fractions chromatographiques FH et FO de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus .................................................................................................................................................................................. 99 1-2-1-2 Détermination de la CMI des fractions chromatographiques FH et FO de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus .............................................................................................................................................................. 101 1-2-2 Chromatographie sur colonne de silice de la fraction oxygénée de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus ................................................................................................................................................. 102 1-2-2-1 Analyses chimiques des fractions chromatographiques FOA et FOB, isolées de la fraction oxygénée FO .. 103 1-2-2-2 Détermination de la CMI des fractions chromatographiques FOA et FOB de la fraction oxygénée FO ...... 105 1-2-3 Bilan ................................................................................................................................................. 106 1-2-3-1 Protocole de fractionnement ..................................................................................................................... 106 1-2-3-2 Activité antibactérienne de l’huile essentielle de Cistus ladaniferus et de ses fractions chromatographiques ................................................................................................................................................................................ 107 1-2-4 Observation en MET des effets cellulaires induits par l’huile essentielle de Cistus ladaniferus et sa fraction oxygénée FOB sur E. aerogenes EA 289 ........................................................................................ 108 2- DISCUSSION ............................................................................................................... 112 2-1 ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS ............................................................ 112 2-2 MOLECULES IMPLIQUEES DANS L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS ................ 113 2-3 EFFETS CELLULAIRES INDUITS PAR LES ALCOOLS TERPENIQUES DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CISTUS LADANIFERUS SUR LA BACTERIE MULTI-RESISTANTE ENTEROBACTER AEROGENES EA289 ............................................................................................. 114 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ..................................................................... 111 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................... 114 ANNEXE : PUBLICATIONS 1 2 Depuis leur découverte au début du XXème siècle, les antibiotiques ont permis de grandes avancées en thérapeutique et contribué à l’essor de la médecine moderne. L’introduction et l’utilisation en clinique des premières classes d’antibiotiques ont considérablement réduit la mortalité imputable à des maladies autrefois incurables. L’efficacité de l’antibiothérapie dans le contrôle et la limitation de la dissémination des agents pathogènes a ainsi fait naître l’espoir de pouvoir éradiquer l’ensemble des maladies infectieuses. Malheureusement, l’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques a mis un terme à cette vague d’optimisme. La montée des résistances est due à la prescription immodérée et souvent inappropriée des antibiotiques. Administrés à titre curatif ou préventif, les antibiotiques favorisent l’élimination des bactéries sensibles et la sélection des plus résistantes. Ce phénomène de résistance aux antibiotiques est général et concerne toutes les espèces bactériennes. Des bactéries résistantes aux diverses classes d’antibiotiques disponibles sur le marché ont, en effet, été identifiées. Certains pneumocoques (Streptococcus pneumoniae), responsables de pneumopathies, de méningites et d'otites, sont devenus résistants à la pénicilline. De même, de nombreuses souches de staphylocoques dorés (Staphylococcus aureus), à l'origine d'abcès ou de septicémies, sont devenues multi-résistantes. Elles sont insensibles à plusieurs antibiotiques, y compris à la vancomycine, qui était, encore très récemment, utilisée comme le médicament du dernier recours. La situation est identique pour les entérocoques (Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis), des bactéries présentes normalement dans uploads/Finance/ tha-se-hal.pdf