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4éme année génie des Industries Alimentaires Année Universitaire: 2014-2015 Cha

4éme année génie des Industries Alimentaires Année Universitaire: 2014-2015 Chargé de Cours: DR. MAATOUK Imed Evaluation de la contamination d’une matrice alimentaire en mycotoxines : cas de l’ochratoxine A GENERALITES L’ochratoxine A (OTA) est une mycotoxine (métabolite secondaire) produite par des champignons du genre Aspergillus et Penicillium, sous l’effet de certaines conditions de température et d’humidité. Elle contamine les denrées alimentaires destinées à l'homme ou aux animaux d'élevage. Outre ses multiples effets toxiques (tératogènicité, carcinogènicité, mutagènicité et immunosuppression), sa néphrotoxicité semble être l’effet prédominant. De plus, elle est considérée comme étant l’agent causal de la Néphropathie Endémique des Balkans (NEB) ainsi que des tumeurs du tractus urinaire. L’ochratoxine A (OTA) a été découverte pour la première fois en 1965 (Van Der Merwe et al., 1965) à l’occasion d’une recherche systématique de mycotoxines. Elle est constituée d’une molécule de L-phénylalanine engageant son groupement amine dans une liaison pseudo-peptidique avec le groupement carboxyle en C7 de la 7-carboxy-3-méthyl-5-chloro-8- hydroxy-3,4-dihydroisocoumarine (Figure 1). Figure 1. : Structure chimique de l’ochratoxine A (C20H18ClNO6 ; PM : 403,82) C’est un composé cristallin incolore, de poids moléculaire 403,8 et de formule brute C20H18ClNO6. A pH acide, l’OTA est soluble dans les solvants organiques polaires et peu solubles dans l’eau. A pH alcalin, elle est soluble et stable dans le bicarbonate de sodium 0,1 M et dans les solutions alcalines en général. Ces propriétés sont utilisées pour l’extraction et la purification de l’OTA à partir de divers types d’échantillons. L’OTA absorbe la lumière Ultra-Violette. Dans le méthanol, le maximum d’absorption est à 333 nm avec un coefficient d’extinction molaire de 5500. Dans le bicarbonate de sodium, 0,1 M pH 7,4, le maximum d’absorption est à 378 nm avec un coefficient d’extinction molaire de 14700. 1 Partie isocoumariniqu e Partie phénylalanin e En milieu acide, l’OTA présente des propriétés de fluorescence (longueur d’onde d’émission = 365 nm), cette fluorescence est verte à 365 nm alors qu’en milieu alcalin, elle est bleue. Cette propriété est mise à profit pour sa détection et son dosage I. Extraction et purification de l’ochratoxine A à partir d’une matrice alimentaire (Farine de blé) A. Principe général d’extraction et d’analyse quantitative des mycotoxines Les méthodes analytiques pour le dosage des mycotoxines sont fondées sur plusieurs facteurs. Aucune méthode n’est directement applicable à tous les types de mycotoxines. Les paramètres primordiaux dans un schéma analytique sont la nature chimique de la ou des mycotoxines d’intérêt, ses groupes fonctionnels mais aussi le type de matrice dans laquelle elles sont recherchées. Les aspects majeurs de l’analyse comprennent l’extraction à partir de la matrice, la purification et la concentration de l’extrait, la détection qualitative et quantitative des mycotoxines. De manière générale, la première étape d’extraction de la mycotoxine à partir de la matrice broyée, s’effectue dans un solvant organique aqueux (Scott, 1995). Les solvants utilisés dans l’extraction des mycotoxines peuvent être le méthanol, le toluène, l’acétonitrile, l’acétate d’éthyl, et le chloroforme. L’utilisation d’un mélange d’eau et de solvant organique permet en humidifiant le substrat d’augmenter la pénétration du solvant. La phase aqueuse est généralement acidifiée afin de casser les interactions entre la ou les toxines et les constituants de l’échantillon tels que les protéines. L’utilisation de sels inorganiques permet de diminuer la formation d’émulsion durant l’extraction lors de cette première étape. D’autres composés peuvent être présents et interférer, par la suite, dans l’analyse chromatographique des mycotoxines. Une étape de purification à partir de l’extrait filtré estalors d’autant plus nécessaire que l’on cherche à atteindre des seuils de quantification le plus bas possible. Cette étape peut être réalisée soit par : - Partage liquide-liquide (LLP), - Extraction sur phase solide (SPE), - Extraction sur colonne d’immunoaffinité (IAC). La dernière étape est l’analyse par chromatographie des échantillons. Plusieurs techniques peuvent être utilisées : - Chromatographie en couche mince (CCM ou TLC), - Chromatographie liquide de haute performance (HPLC) couplée à un détecteur UV ou à un détecteur de fluorescence. - Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) ou HPLC couplée à l’ionisation par electrospray (ESI). B. Extraction de l’ochratoxine A à partir de la farine de Blé 2 1. Matériel  Farine de blé  Papiers filtre  Eprouvettes de 100 ml  Erlenmeyers de 250 ml  Tubes à centrifuger de 50 ml  Tubes eppendorfs de 1,5 ml  Ballons d’évaporation de 50 et 100 ml  Tubes à essaies  Centrifugeuse  Evaporateur rotatif  Seringues et Filtres seringues de 0,45 µm 2. Réactifs et produits chimiques  Chloroforme  Hexane  Acide sulfurique (0,1 M)  Méthanol  T oluéne  Acétate d'éthyle  Acide formique 3. Mode opératoire 10 g de la farine du blé est mis en agitation mécanique pendant 30 minutes en présence d’un mélange de 30 ml du chloroforme et 2,5 ml de d’acide sulfurique 0,1 M. Le mélange est ensuite filtré et 10 ml du filtrat est prélevé pour être évaporé à sec à 60°C. Le résidu est reconstitué dans 500 µl du méthanol (vortex 1 min). l’extrait méthanolique subit une délipidation par 1ml de hexane. Après centrifugation (6000 rpm, 20 min), la phase organique inférieure est récupérée et filtré sur un filtre de 0,45 µm préalablement conditionné avec du méthanol. 3 AVERTISSEMENT 1: - L'ochratoxine A provoque des lésions au niveau des reins et du foie et elle est probablement cancérigène. Respecter les précautions de sécurité lors des manipulations de ces composants ; éviter notamment toute manipulation du produit sous une forme sèche, du fait de sa nature électrostatique qui peut occasionner une dispersion et une inhalation. Il convient de décontaminer la verrerie avec une solution d'hypochlorite de sodium à 4 %. - Utiliser une hotte d'extraction en bon état de marche. Éviter le contact avec la peau, les yeux et les voies respiratoires. II. Détection et quantification de l’ochratoxine A par Chromatographie sur Couche Mince (CCM) 1. Principe général Plusieurs protocoles sont développés par l’AOAC (1995) (Official Methods 973.37 et 975.38), notamment pour la recherche de l’OTA. La chromatographie sur Couche Mince (CCM) est l’une des méthodes utilisées dans la détection et la quantification de l’OTA. Ainsi, la détection et la quantification de la mycotoxine peuvent se réaliser sous lampe UV ou, mieux, par fluorescence. La lecture peut se faire visuellement par comparaison des intensités avec des solutions étalons ou bien grâce à un lecteur de fluorodensitométrie (excitation : 310- 340 nm, émission : 440-475 nm). La fluorescence de l’OTA peut être renforcée, elle vire au bleu intense en présence de vapeurs d’ammoniac ou par vaporisation d’une solution basique (soude, bicarbonate). 2. Mode opératoire de la CCM Les extraits alimentaires obtenus sont chromatographiés (volume du dépôt de 10 µl) sur gel de silice (plaque de Gel de Silice) avec un solvant de migration : Toluène : acétate d’éthyl : Acide formique (6 : 3 : 1). Le temps de migration est égal à 1h30. Après migration, la 4 plaque est séchée à l’air ambiant sous hôte. Les tâches fluorescentes de l’OTA (bleu-vert) sont visualisées sous UV (lampe UV (366 nm)). Pour chaque tâche visualisée, on détermine le RF ou mobilité relative ( rapport entre la distance de migration (Dm) de la tâche fluorescente et la distance du front du solvant (Df)). RF= Dm/Df AVERTISSEMENT 2: - La migration se déroule sous hotte vue que le toluène est cancérogène ; - Le niveau du solvant de migration est inférieur à celui de dépôt, pour que le solvant entraîne avec lui le produit déposé lors de sa migration sur la plaque ; 3. Dosage spectrophotomètrique Après révélation des spots de l’OTA, on procédé à quantifier la toxine par méthode spectrophotométrique comme suit : - Grattage des tâches visualisées sur la plaque du Silice ; - Solubilisation (Silice + OTA) dans 1ml de MeOH avec un coup de vortex afin d’augmenter le contact de l’OTA avec le MeOH ; - Centrifugation pendant 5 minutes à 13000 tours/min pour précipiter la Silice ; - La lecture de la DO à 330 nm sera déterminée dans une cuve de 1 ml de Quartz par spectrophotomètre UV/Visible. Après établissement de la courbe étalon exprimant la DO en fonction des concentrations connues (5 ; 10 ; 100 ; et 500 ppb) de l’OTA, on déterminera la quantité de l’OTA dans les extraits alimentaires obtenus. 4. Expression des résultats : 1- Etablir la courbe d’étalonnage DO= f([OTA]) et déterminer la concentration de l’OTA en ng/ml dans les extraits analysés. 2- Exprimer la concentration de l’OTA en µg/kg dans les extraits analysés. 5 Chromatographie sur couche mince (CCM) 3- Calculer le rendement de la méthode d'extraction sachant que la solution de dopage utilisée pour la contamination artificielle de la farine de Blé est de 50 µg /kg. Rendement (%)= [OTA]Exp/[OTA]Théorique*100 6 uploads/Finance/ tp-toxico-ota.pdf