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UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL SUREXPRESSION DE LA GLUCOSE-6-PHOSPHATE DÉSHYDROGÉNASE P

UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL SUREXPRESSION DE LA GLUCOSE-6-PHOSPHATE DÉSHYDROGÉNASE POUR L’ÉTUDE DU MÉTABOLISME PRIMAIRE DE CELLULES DE MAMMIFÈRES EN MODE CUVÉE EDWIGE ARNOLD DÉPARTEMENT DE GÉNIE CHIMIQUE ÉCOLE POLYTECHNIQUE DE MONTRÉAL MÉMOIRE PRÉSENTÉ EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLÔME DE MAÎTRISE ÈS SCIENCES APPLIQUÉES (GÉNIE CHIMIQUE) AOÛT 2015 © Edwige Arnold, 2015. UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL ÉCOLE POLYTECHNIQUE DE MONTRÉAL Ce mémoire intitulé: SUREXPRESSION DE LA GLUCOSE-6-PHOSPHATE DÉSHYDROGÉNASE POUR L’ÉTUDE DU MÉTABOLISME PRIMAIRE DE CELLULES DE MAMMIFÈRES EN MODE CUVÉE présenté par : ARNOLD Edwige en vue de l’obtention du diplôme de : Maîtrise ès sciences appliquées a été dûment accepté par le jury d’examen constitué de : M. HENRY Olivier, Ph. D., président M. JOLICOEUR Mario, Ph. D., membre et directeur de recherche Mme HOEMANN Caroline, Ph. D., membre iii DÉDICACE «To see a World in a Grain of Sand And a Heaven in a Wild Flower, Hold Infinity in the palm of your hand And Eternity in one hour.» William Blake iv REMERCIEMENTS Je souhaite dans un premier temps remercier mon directeur de maîtrise, le Professeur Mario Jolicoeur, tant sur les plans professionnel qu’humain, pour m’avoir fait confiance tout au long du projet et prodigué des conseils avisés. Je le remercie également pour m’avoir permis d’avoir mes premières expériences d’enseignement. Merci à Ines pour avoir initié ce projet avec moi et m’avoir formée. A vous deux, vous avez réussi à me donner le goût de la culture cellulaire. Je remercie tous les partenaires sans qui ce projet n’aurait pas été possible : Dr. Patrick Benoist et Dr. Patrick Daoust de Viropro International Inc. pour les cellules CHO-HP, Dr. Yves Durocher de l’IRB pour les cellules HEK, le réseau Mabnet pour les cellules CHO-EG2, Dr. Sachin A. Gupte pour le plasmide. Je suis reconnaissante envers l’École Centrale de Marseille pour m’avoir donné la possibilité de poursuivre mes études à l’étranger; cette expérience est certainement une des plus enrichissantes et bénéfiques de ma vie. Un grand merci à tous les étudiants, et amis du laboratoire, ça aurait été ben moins l’fun sans vous. Du coup, je remercie Julien quoi, pour avoir bien trop secoué sa lunch box à côté de mon oreille et ses prévisions météo en chinois, merci à Xiaojie et Xinhe pour les dits cours de chinois. Merci à Anaïs et Cécile pour les conversations féministes, à Kahina pour les soirées grasses, à Yuan pour les parties de badminton, à Adrien pour la MAD JAK, à Charles, Sam, Fred, Éric, Benoît, Olga, Aldo, Pauline, Nesrine, July, Guillaume, Cyril, Sofia, Zhihui, Prajwal, Mengjiao, Florian, Adeline, Laurence et Mayssa pour leurs sourires et toutes les conversations et soirées partagées. Une attention particulière pour Jingkui, tant pour son support technique que sa bonne humeur et pour Christian, le meilleur agent de sécurité ever. À Jean-Sébastien et Jasmin que j’ai eu le plaisir de superviser lors de leurs stages, j’espère que votre expérience a été aussi enrichissante que la mienne. Enfin, ces dernières lignes vont directement à ma famille, mes amis et à Sylvain. Merci d’avoir rendu ces moments enrichissants. Merci à Sylvain pour son soutien inégalable (et pour m’avoir supportée!), j’espère que tu le feras encore longtemps. Une pensée pour la petite Tiny qui m’attend en miaulant derrière la porte tous les soirs. À vous, à nous! v RÉSUMÉ Les cellules de mammifères sont l’hôte privilégié pour la production de protéines recombinantes d’intérêt thérapeutique, et parmi elles, les cellules CHO qui dominent le marché et les cellules HEK qui connaissent un regain d’intérêt. Même si elles présentent l’avantage de performer les modifications post-traductionnelles appropriées pour la compatibilité des molécules avec l’être humain, les coûts de production demeurent important devant la demande croissante. De plus, ces cellules présentent un métabolisme lent et n’atteignent pas des densités cellulaires aussi élevées comparé aux microorganismes. De nombreuses améliorations ont été obtenues grâce à l’optimisation des milieux de culture et stratégies de culture, l’amélioration des lignées, et plus récemment l’essor des études sur le métabolisme cellulaire. L’identification des limitations du métabolisme a permis d’orienter les stratégies d’ingénierie des lignées, notamment pour limiter l’effet des sous-produits toxiques de culture ou l’activation des voies apoptotiques. Récemment, des études ont montré un changement de métabolisme entre la phase de croissance et la phase de production. En phase exponentielle, la majorité des flux sont dirigés vers la glycolyse alors que le pic de production correspond à une activité majoritaire des branches oxydatives comme le cycle des acides tricarboxyliques et la voie des pentoses phosphates. C’est dans ce cadre que s’inscrit le présent projet qui consiste en la redirection des flux métaboliques vers la voie des pentoses phosphates. En accord avec les prévisions d’un modèle métabolique disponible dans notre laboratoire, il a été supposé qu’une augmentation de l’activité de la glucose-6-phosphate déshydrogénase, première enzyme de la voie, permettrait de rediriger les flux vers la voie des pentoses phosphates et de soulager la charge métabolique imposée par la production de protéines recombinantes. Cette enzyme a donc été transfectée de manière transitoire dans des cellules HEK293, une lignée parentale et une lignée dérivée exprimant la pyruvate carboxylase, et des cellules CHO afin d’observer son effet sur la production de protéines et la croissance cellulaire en mode cuvée. Les résultats en termes de croissance cellulaire, viabilité, production de protéines et concentrations de métabolites intracellulaires comme extracellulaires ont révélé la robustesse du métabolisme de ces cellules face à la perturbation étudiée. En revanche, les signatures métaboliques des deux lignées cellulaires HEK293 sont très caractéristiques, en raison des changements importants apportés par la pyruvate carboxylase. vi ABSTRACT Mammalian cells are the prefered host for the production of recombinant proteins of therapeutic interest. Among them, CHO cells are prevailing on the market and HEK are raising interest. Even if they possess the advantage of performing appropriate post-translational modifications for human compatibility of those molecules, production costs are still inhibitory regarding the growing demand. Moreover, mammalian cells possess a slow metabolism and can’t reach high cell densities compared to what is observed in microorganisms. Numerous significant improvements have been made thanks to media and culture strategies optimization, cell lines improvement, and more recently the advances in cell metabolism studies. The identification of metabolism bottlenecks allowed to guide cell line engineering, especially to avoid toxic effects of metabolic by-products or activation of pro-apoptotic signals. Recently, studies have shown a metabolic switch between growth phase and production phase. In exponential phase, most of the flux are routed towards glycolysis. However, pic protein production was associated with an elevated oxidative metabolism in the TCA cycle and the pentose phosphate pathway. Given that, the present work aims at redirecting metabolic fluxes through the pentose phosphate pathway. According to a predictive metabolic model developped in our laboratory, we hypothetized that an increase in glucose-6-phosphate dehydrogenase – the first enzyme in the pathway- activity could reroute the fluxes and aleviate the metabolic burden imposed by recombinant protein secretion. This enzyme was thus transient transfected in two HEK293 cell lines, the parental cells and the derived cell line stably expressing pyruvate carboxylase, and CHO cells in order to assess its effect on protein production and cell growth in batch mode. The results, in terms of growth, viability, recombinant protein production, and the concentrations of intra- and extracellular metabolites demonstrated the robustness of these cells regarding the pertubation studied in this work. However, metabolic signatures of the two HEK293 cell lines is really characteristic of the changes brought by the expression of pyruvate carboxylase in one of the cell lines. vii TABLE DES MATIÈRES DÉDICACE ................................................................................................................................... III! REMERCIEMENTS ..................................................................................................................... IV! RÉSUMÉ ........................................................................................................................................ V! ABSTRACT .................................................................................................................................. VI! TABLE DES MATIÈRES .......................................................................................................... VII! LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................................. XI! LISTE DES FIGURES ................................................................................................................ XII! LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS ............................................................................. XIV! LISTE DES ANNEXES .......................................................................................................... XVIII! CHAPITRE 1! INTRODUCTION ................................................................................................ 1! CHAPITRE 2! REVUE DE LITTÉRATURE ............................................................................... 5! 2.1! L’importance des cellules de mammifères en tant que plateforme de production .............. 5! 2.1.1! Généralités .................................................................................................................... 5! 2.1.2! Modifications post-traductionnelles ............................................................................. 8! 2.1.3! Conditions et modes de culture .................................................................................. 11! 2.1.4! Milieux de culture ...................................................................................................... 13! 2.1.5! Métabolisme ............................................................................................................... 15! 2.1.5.1! Glycolyse ............................................................................................................. 17! 2.1.5.2! Voie des pentoses phosphates ............................................................................. 17! 2.1.5.3! Cycle des acides tricarboxyliques ....................................................................... 19! 2.1.5.4! Énergétique .......................................................................................................... 20! 2.2! Ingénierie cellulaire et stratégies de culture pour l’augmentation de la production ......... 21! 2.2.1! Systèmes d’expression inductibles ............................................................................. 21! viii 2.2.2! Stratégies anti-apoptose .............................................................................................. 23! 2.2.3! Diminuer l’accumulation de déchets toxiques ........................................................... 26! 2.2.4! Modélisation du métabolisme .................................................................................... 29! 2.2.5! Analyses des flux métaboliques ................................................................................. 34! 2.2.6! Le rôle et l’intérêt de la G6PDH ................................................................................ 37! 2.3! Transfection ....................................................................................................................... 45! 2.3.1! Transfection transitoire vs lignée stable ..................................................................... 45! 2.3.2! Différentes méthodes .................................................................................................. 46! 2.3.3! Facteurs influençant la transfection au PEI ................................................................ 48! 2.3.4! Sélection des clones ................................................................................................... 50! CHAPITRE 3! MATÉRIEL ET MÉTHODES ........................................................................... 55! 3.1! Lignées cellulaires et conditions de culture ...................................................................... 55! 3.1.1! CHO-HP ..................................................................................................................... 55! 3.1.2! CHO-EG2 ................................................................................................................... 55! 3.1.3! HEK293 ...................................................................................................................... 55! 3.1.4! Conditions de culture ................................................................................................. 56! 3.1.5! Adaptation des cellules à un nouveau milieu de culture ............................................ 56! 3.1.6! Congélation et décongélation des uploads/Geographie/ 2015-edwigearnold-pdf.pdf